肺癌组织中14-3-3ζ的表达与上皮细胞间质转化的相关性研究

王琳琳，于洪升，蒋捍东，2

(1青岛大学医学院附属医院，山东青岛266003;2上海交通大学附属仁济医院)

近年研究发现，上皮细胞间质转化(EMT)在各种上皮细胞来源的恶性肿瘤侵袭转移过程中发挥了重要作用［1］，是恶性肿瘤转移的早期事件。所以EMT相关因子的研究逐步成为热点，并有望为肿瘤靶向治疗提供新的依据。14-3-3蛋白是一个广泛表达的酸性蛋白家族，最初在脑脊液提取物中被发现，14-3-3蛋白的亚型与肿瘤的发生密切相关，并被作为潜在的肿瘤抑制基因或致瘤基因，近年来14-3-3ζ与肺癌的研究逐渐增多，但与EMT和肿瘤转移的关系研究很少，本研究采用免疫组化法检测14-3-3ζ与上皮性钙黏附素(E-cad)、波形蛋白(vimentin)在肺癌组织中的表达，并分析14-3-3ζ与E-cad、vimentin的相关性及其临床病理特征，以期揭示14-3-3ζ在EMT和肿瘤转移中的作用及其临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料 收集青岛大学医学院附属医院2008～2011年手术切除的60例肺癌患者石蜡包埋组织(患者术前均未经过化疗和放疗)，其中鳞癌34例，腺癌26例;高分化16例，中分化23例，低分化21例;淋巴结转移36例，无淋巴结转移24例。以35例肺癌患者癌旁正常肺组织作对照。鼠抗人E-cad和vimentin单克隆抗体及DAB显色试剂盒由北京中杉金桥生物有限公司提供。鼠抗人14-3-3ζ和craf单克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 检测方法 免疫组织化学染色:切片、组织切片进行预处理、阻断内源性过氧化物酶、抗原修复、滴加一抗、滴加通用型IGG抗体-HRP多聚体、应用DAB溶液显色。苏木静复染，常规脱水，透明，封片。结果判定:免疫组化染色以胞膜、胞质和胞核内出现棕黄色颗粒为阳性，按照染色强度与阳性细胞百分比的乘积评分:即0～2分(－)，3～4分(+)，5～7分(++)，8～9分(+++)。参考 Sarrio等［2］方法，选择E-cad表达阴性同时vimentin表达阳性的病例，记为EMT(+)。

1.2.2 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件，组间表达差异的分析采用χ2检验，各因子表达的相关性采用Pearson相关分析。P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 E-cad、vimentin 在肺癌的表达 E-cad 阳性表达于细胞膜和(或)胞质上，vimentin表达在胞质上。见图1、2。肺癌中E-cad和vimentin的阳性表达率分别是 31.70%(19/60)、51.70%(31/60)，正常肺组织分别是77.10%(27/35)、0(0/35)。肺癌组织与正常肺组织的E-cad及vimentin阳性表达比较有统计学差异(χ2值分别为 18.30、26.84，P 均 ＜0.01)。

图1 E-cad在肺癌组织中的表达(HE，×200)

图2 vimentin在肺癌组织的表达(HE，×200)

2.2 14-3-3ζ、c-raf在肺癌组织中的表达 肺癌组织中14-3-3ζ阳性表达在细胞质和膜上，c-raf阳性表达在细胞质中，镜下呈棕黄色颗粒。见图3、4。14-3-3ζ、c-raf在肺癌组织中的阳性表达率分别是45.00%(27/60)、30.00%(18/60)，在正常肺组织分别为5.71%(2/35)、2.85%(1/35)，肺癌组织中的14-3-3ζ、c-raf阳性表达明显高于正常肺组织(χ2值分别为16.09、10.18，P 均 ＜0.01)。

图3 14-3-3ζ在肺癌组织中的表达(HE，×200)

图4 c-raf在肺癌组织中的表达(HE，×200)

2.3 肺癌组织中 14-3-3ζ、c-raf、E-cad、vimentin 的表达与临床病理特征的关系 见表1。

表1 肺癌组织中14-3-3ζ、c-raf、E-cad、vimentin的表达与临床病理特征的关系(例)

2.4 肺癌组织中14-3-3ζ、c-raf的表达与EMT的相关性 EMT(+)组肺癌组织中14-3-3ζ、c-raf的阳性表达率分别是 79.20%(19/24)、54.20%(13/24)，EMT(－)组肺癌组织中14-3-3ζ、c-raf的阳性表达率分别是 22.20%(8/36)、13.90%(5/36)，即 14-3-3ζ、c-raf在EMT(+)组的阳性表达率明显高于EMT( －)组(χ2值分别为 18.87、11.12，r值分别为0.925、0.820，P 均 ＜0.01)。

2.5 肺癌组织中14-3-3ζ的表达与c-raf的相关性c-raf(+)组中14-3-3ζ的阳性表达率是72.20%(13/18)，c-raf(－)组肺癌组织中14-3-3ζ的阳性表达率是 33.30%(14/42)，即 c-raf(+)组 14-3-3ζ的阳性表达明显高于 c-raf(－)组(χ2=7.699，r=0.705，P ＜0.01)。提示14-3-3ζ与c-raf在肺癌组织中的异常表达存在相关性。

3 讨论

14-3-3蛋白是一个广泛表达的酸性蛋白家族，它的亚型与肿瘤的发生密切相关，并被作为潜在的肿瘤抑制基因或致瘤基因［3，4］，因此，14-3-3 蛋白的不同亚型可以为抗癌治疗提供新的途径。14-3-3ζ是该家族中的一个亚型，有关14-3-3ζ与肺癌的关系已逐渐成为研究热点。Qi等［5］利用RT-PCR和Western blot检测到正常肺组织中14-3-3ζ的微量存在，而肺癌组织中表达增高。臧东钰等［6］研究发现，14-3-3ζ在正常肺组织中微量表达，在NSCLC中表达显著增多，且随着肺癌分化程度的降低，其阳性表达率逐渐增强。本实验发现，14-3-3ζ在正常肺组织中阳性表达率低于肺癌组织，同时高中分化组阳性表达率低于低分化组，提示14-3-3ζ的表达与肺癌的分化程度存在相关性，可能促进了肺癌的发生和发展。本研究中淋巴结转移阳性组14-3-3ζ的表达率高于淋巴结转移阴性组，与臧东钰等［6］结果一致，由此认为14-3-3ζ在癌细胞的侵袭和淋巴结转移中也发挥了至关重要作用。

EMT的特征主要是失去上皮细胞特性，表达间质细胞特点［7］，表现为E-cad蛋白的下降，vimentin表达的增加，导致细胞运动力增强，增加肿瘤的侵袭性和转移性。EMT存在于人体多个生理和病理过程中，它的发生涉及到多个信号转导通路和复杂的分子机制，其中一条重要的通路是受体酪氨酸激酶ras/MAPK通路，丝氨酸/苏氨酸酶 c-raf信号作为ras的效应物，反作用于TGF-β的生长抑制和诱导凋亡，强化TGF-β的致侵袭效应，从而诱导MDCK细胞(Madin-Darby canine kidney，一种英国小猎犬的肾细胞)发生EMT。Huang等［8］在对前列腺癌的研究中发现此信号通路可通过TGF-β的介导，增强MMP-2的分泌，最终导致肿瘤细胞的侵袭。Janda等［9］的研究结果表明，c-raf可以减少E-cad的表达，降低细胞间黏附作用，促进EMT的发生。本研究也发现，EMT(+)组肺癌组织中c-raf的阳性表达高于EMT(－)组，我们推测c-raf作为ras的效应物在ras/MAPK通路调控EMT的过程中起着重要作用，促进了EMT的发生。

有研究表明，ras作为c-raf的活性刺激因子不能充分活化c-raf，需要14-3-3ζ等参与，14-3-3ζ作用下的c-raf在无活性与有活性形式间快速转变，14-3-3ζ蛋白的结合有助于靶蛋白活性调控信号的输入，并在维持c-raf高度催化活性中发挥重要作用，14-3-3ζ可能是c-raf和ras复合物形成的协同分子［10］。Petosa等［11］研究发现，14-3-3ζ蛋白通过与 c-raf结合调节受体酪氨酸激酶ras/MAPK信号通路，促进肿瘤转移。Matta等［12］研究发现，14-3-3ζ和EMT 标记蛋白β-catenin之间具有相关性，β-catenin可能是14-3-3ζ作用的一个靶点。本实验显示，14-3-3ζ的表达与c-raf存在相关性;14-3-3ζ在EMT(+)组的阳性表达率明显高于EMT(－)组，我们推测14-3-3ζ在EMT过程中发挥着重要作用，促进了EMT的发生，进而促进肿瘤的转移，受体酪氨酸激酶ras/MAPK信号通路可能是其调控EMT的一条途径，在此通路中c-raf可能是14-3-3ζ的一个作用靶点，所以14-3-3ζ的深入研究将有望为肺癌的诊断和治疗开辟一条新的途径。

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