MTHFR基因多态性与脑卒中的相关性

张海洋 张金华 张会敏 (新乡医学院第一附属医院小儿外科，河南 卫辉 45300)

脑卒中是遗传因素和环境因素共同引起的一种疾病，为人类疾病的三大死因之一，其病因学研究及防治成为研究热点。近年来研究发现脑梗死的发生与高同型半胱氨酸(Hcy)血症关系密切〔1〕，N5，N10亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是 Hcy代谢的关键酶之一，MTHFR基因突变导致酶活性下降，使血浆Hcy浓度升高及DNA低甲基化〔2〕，从而造成一系列病理改变，引发多种疾病。目前研究较多的是MTHFR基因突变为C677 T点突变，其频率分布受人种、地域等因素的影响较大并且其多态性与脑卒中的关系目前国内外研究还存在争议〔3〕。本研究分析冠心病和与之年龄及性别匹配的对照人群的MTHFR基因C677 T多态性，探讨二者的相关性。

1 对象与方法

1.1 对象 2008年1月至2009年12月我院住院脑卒中患者151例，选取年龄、性别相匹配的151例同期住院患其他疾病患者或体检中心健康志愿者作为对照组。脑卒中组患者经过头颅MRI和(或)CT扫描明确诊断，符合1996年第四届全国脑血管病会议修订的诊断标准，并排除脑出血和占位性病变。对照组均无冠心病和脑血管病史。脑卒中组平均年龄(65.8±9.25)岁，男89例;对照组平均年龄(65.1±11.34)岁，男85例。两组在性别、年龄方面无显著差异(P＞0.05)，两组均进行血糖、血脂、Hcy等检测。

1.2 DNA的提取和浓度测定 抽取患者空腹外周静脉血4 ml于EDTA抗凝管中，存放于－20℃冰箱。集中提取DNA。用人全血DNA提取试剂盒(购于德国BMS公司)提取DNA后，存放于－20℃冰箱。用核酸蛋白浓度测定仪测定抽提基因组DNA浓度，并将保存的基因组模板DNA原液用DNA溶解液稀释(GENTRA公司Puregene试剂盒)至终浓度5～10 ng/μl。

1.3 MTHFR基因型测定 采用聚合酶链式反应限制性酶切片段长度多态性(PCR－RFLP)分析法，扩增引物序列如下:上游5′－CAAAGGCCACCCCGAAGC－3′和下游 5′－AGGACGGTGCGGTGAGAGTG－3′，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。反应体系 25 μl:1 mmol/L MgCl2、dNTP 200 μmol/L、正反引物各 0.5 μmol/L、TaqDNA 聚合酶2 U、模板 DNA 5 μg。PCR 扩增条件如下:94℃5 min，94℃30 s，56℃40 s，72℃40 s，35 个循环，末次延伸7 min;取8 μl PCR反应产物，加4 U限制性内切酶HinfⅠ，反应体积 20 μl，酶切 4 h。取 8 μl酶切产物，12% 聚丙烯酰胺凝胶电泳2 h，溴乙啶(EB)染色30 min，UVP凝胶成像系统摄像判断基因型。

1.4 Hcy测定 使用乙二胺四乙酸抗凝管采集患者清晨空腹静脉血10 ml分离血浆后立即 －20℃冻存，1 w内转移入－80℃冻存，应用高效液相色谱(HPLC)法测定血液中Hcy:采用Agilent1100液相色谱仪，色谱柱为 HypersilC18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相为0.04 mol/L醋酸缓冲液，流速0.8 ml/min;进样量20 μl;柱温25℃;分析时间15 min;荧光检测条件:激发波长382 nm，发射波长470 nm。样本两次测定值误差不超过15%。Hcy正常值设定在＜10 μmol/L，超过10 μmol/L定义为高 Hcy 血症(HHcy)〔2〕。

1.5 统计学处理 采用SPSS13.0软件进行计量资料非配对t检验及方差分析、计数资料Hardy－Weinberg平衡χ2检验。

2 结果

2.1 两组平均血浆Hcy浓度比较 脑卒中组血浆Hcy浓度〔(24.69 ± 4.32)μmol/L〕明 显 高 于 对 照 组 〔(8.98±2.79)μmol/L〕(t=7.112，P ＜0.001)。

2.2 两组MTHFR基因型和等位基因频率比较 PCR扩增产物片段为246 bp，HinfⅠ酶切结果显示MTHFR基因型有3种，分别为野生型(C/C)、杂合子型(C/T)、纯合子突变型(T/T)，包含C等位基因的246 bp片段不被HinfⅠ酶切，含T等位基因的片段被HinfⅠ酶切为175和198 bp两个片段(图1)。脑卒中组MTHFR(C677 T)C/C、T/T基因型频率和C、T等位基因频率明显低于对照组(P＜0.05)(表1)。

图1 PCR-RFLP电泳结果

表1 两组MTHFR(C677 T)基因型和等位基因频率〔n(%)，n=151〕

3 讨论

Hcy已被证实是动脉粥样硬化的独立危险因子，而MTHFR是Hcy代谢中的关键酶。对MTHFR基因多态性的研究多集中在C677 T位点。研究表明，MTHFR基因cDNA序列上第677位核苷酸C→T突变，产生一个HinfⅠ限制性内切酶识别序列，变化的结果使编码的氨基酸由丙氨酸变成缬氨酸，从而造成MTHFR活性及耐热性降低，使催化N5，N10－亚甲基四氢叶酸反应并提供甲基给Hcy进行转甲基代谢的能力下降，导致Hcy代谢障碍，最终血浆中Hcy水平增高〔4〕。

缺血性脑卒中包括脑血栓形成、腔隙性梗死和脑梗死等，是指因脑部血液循环障碍，缺血、缺氧所致的局限性脑组织的缺血性坏死和软化，并出现偏瘫、偏身感觉障碍、偏盲、言语障碍、眩晕、吞咽困难、共济失调等一系列局灶性神经功能缺损症状和体征〔5〕。发病原因很复杂，是很多因素作用的结果，流行病学和动物模型均表明脑梗死是遗传性疾病，有关脑梗死基因多态性的研究也涉及炎症细胞因子基因、载脂蛋白基因、血管紧张素转换酶基因、血浆纤维蛋白原因子、一氧化氮合酶、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白3(ERPINA3)、环氧合酶－2(COX－2)基因、MTHFR等〔6〕。其中MTHFR是研究热点，但国内外研究结果并不一致，Cronin等〔7〕认为MTHFR基因多态位点的不同是意大利人脑梗死的危险因素，而Szolnoki等〔8〕在匈牙利人群发现MTHFR基因型的C677 T变异与急性脑梗死无相关性。邵燕等认为高Hcy血症是脑梗死的独立危险因素，单纯的MTHFR C667 T突变既不能产生高Hcy血症，也不能被确定为老年脑梗死的独立危险因素〔9〕。本结果结果提示C677 T突变与河南豫北地区汉族人群脑梗死发生有着密切关系，可能是其发病的遗传危险因素之一，同时脑卒中组血浆Hcy升高可能与MTHFR基因位点突变有关。上述各研究结果间存在差异，可能与种族不同、地域不同、样本大小不同有关以及基因与基因间、基因与环境间的相互作用不同有关。总之，MTHFR基因C677 T多态性与脑梗死的确切关系有待扩大样本量深入研究。

1 Stampfer MJ，Malinow MR，Willett WC，et al.A prospective study of plasma homocysteine and risk of myocardial infarction in US physicians〔 J〕.JAMA，1992;268(7):877－81.

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3 Trabetti E.Homocysteine，MTHFR gene polymorphisms，and cardio cerebrovascular risk〔J〕.J Appl Genet，2008;49(3):267－82.

4 Nahar A，Sabo C，Chitlur M，et al.Plasma homocysteine levels，methylene tetrahydrofolate reductase polymorphisms，and the risk of thromboembolism in children〔J〕.J Pediat Hematol Oncol，2011;33(5):330－3.

5 尤黎明，吴 瑛.内科护理学〔M〕.第4版.北京:人民卫生出版社，2008:612.

6 李 静，杨文明.脑梗死致病基因多态性热点研究〔J〕.中西医结合心脑血管病杂志，2011;9(6):740－3.

7 Cronin S，Furie KL，Kelly PJ.Dose related association of MTHFR C677T allele with risk of ischemic stroke:evidence from accumulative meta analysis〔J〕.Stroke，2005;36(7):1581－7.

8 Szolnoki Z，Somogyvari F，Szabo M，et al.Interactions between the MTHFR C677T and MTHFR A1298C mutations in ischemic stroke〔J〕.Ideggyogy Sz，2006;59(34):107－12.

9 邵 燕，章成国，胡学强.血浆同型半胱氨酸及其酶基因多态性与老年脑梗死的关系〔J〕.临床神经病学杂志，2006;19(1):22－4.