吸烟对2型糖尿病大鼠肾脏中期因子表达的影响

王晓蕾 时艺珊 柏 松 (沈阳医学院沈洲医院内分泌科，辽宁 沈阳 110002)

2007年中国糖尿病患者人数已达3980万，预计2025年将达到5930万〔1〕。对糖尿病易患因素及其发病机制的研究已经引起学者们的极大关注。吸烟是导致人群多种疾病发生和死亡的重要影响因素。研究表明，吸烟与糖尿病(尤其2型糖尿病)及其并发症的发病有明确关系〔2〕。本研究通过观察吸烟的2型糖尿病大鼠肾脏组织中期因子(midkine，MK)的表达情况，分析吸烟对糖尿病肾病发病的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组 取60只Wistar大鼠(购自中国医科大学)，8周龄，雄性，清洁级。体重130～200 g。去除体重差异较大的大鼠，随机分配为三组。①正常对照组20只。②2型糖尿病非吸烟组20只。③2型糖尿病吸烟组20只。

1.1.2 主要设备及试剂 链脲佐菌素(streptoztocin，STZ，美国Sigma公司);颗粒饲料(购自中国医科大学);高糖高脂饲料(自配);香烟为市售X牌香烟，尼古丁含量1 mg/支，焦油含量18 mg/支。RNA提取试剂盒、cDNA合成试剂盒及RT－PCR试剂盒(美国Ambion公司)。按GenBank合成引物。日立7170全自动生化仪(日本日立公司);PCR仪(德国Biometra公司);Chemi Imager 5500凝胶图像系统(美国Alpha Innotech公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立 ①确定胰岛素抵抗动物模型:三组大鼠均每笼3～4只，饲养7 w，室温21℃ ～26℃，湿度 50% ～60%，12 h光照周期，动物室内每天清扫消毒。正常对照组予普通饲料喂养，2型糖尿病吸烟组及2型糖尿病非吸烟组给予高糖高脂饲料喂养。饮水为纯净水。三组7 w时测空腹血糖及胰岛素，确定胰岛素抵抗动物模型。②小剂量STZ静脉注射诱导2型糖尿病模型〔3〕:2型糖尿病吸烟组及2型糖尿病非吸烟组大鼠尾静脉注射STZ 15 mg/kg(以pH4.5的0.1 mmol/L枸橼酸钠缓冲液配成0.3%浓度)，对照组仅注射枸橼酸钠缓冲液。三组继续原饲料喂养1 w后测空腹血糖及胰岛素。确定2型糖尿病动物模型。③将2型糖尿病吸烟组大鼠20只关进自制“被动吸烟箱”内。吸烟箱上方有通风口与外界相通，侧壁有与香烟直径相通的孔，保证香烟烟雾由侧壁孔可逐渐扩散至整个吸烟箱内。大鼠在此环境中“吸烟”，频率设定为每天吸烟2次，每两次间隔4 h，每次30 min。2型糖尿病非吸烟组及对照组大鼠同时也被关进其他“吸烟箱”相同时间，不输入香烟烟雾。4 w后检测三组空腹血糖、空腹胰岛素及尿白蛋白水平。

1.2.2 空腹血糖、胰岛素及尿白蛋白测定 第0周、第7周、第8周、第12周各测一次空腹血糖、空腹血清胰岛素水平(禁食水12 h后尾静脉采血)。计算胰岛素抵抗指数。胰岛素抵抗指数=空腹血糖(mmol/L)×空腹血清胰岛素(mU/L)/22.5〔4〕。第0周、第7周、第8周、第12周各测一次尿白蛋白。

1.2.3 PCR法检测MK的基因表达 实验12 w时三组大鼠均处死，取肾脏组织冷冻保存。应用RNA提取液提取总RNA。按试剂盒说明合成cDNA。设计MK正向和反向引物:上游5′－CCTGCAACTGGAAGAAGGAG－3′，下游 5′－CTTTGGCCTTTGACTTGGTC－3′，扩增产物片段长度为 189 bp。内参照 β－actin 引物序列上游 5′－GGGAAATCGTGCGTGACAT－3′，下游 5′－GTTCTAGTAACCAGGAGGACT－3′，扩增产物片段长度为 385 bp。RT－PCR反应循环扩增条件为94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸50 s;循环35个周期，72℃延伸3 min。2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察，拍照。应用密度系统分析电泳带的密度。

1.3 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件，数据资料以±s表示。多组间均数比较采用单因素方差分析，两组间均数采用t检验。

2 结果

2.1 第12周时各指标比较 2型糖尿病吸烟组及2型糖尿病非吸烟组空腹血糖、胰岛素水平及胰岛素抵抗指数均明显高于对照组，结果有统计学意义(P＜0.05);2型糖尿病吸烟组各指标也明显高于2型糖尿病非吸烟组，结果有统计学意义(P＜0.05)。2型糖尿病吸烟组及2型糖尿病非吸烟组尿白蛋白定量明显高于对照组，结果有统计学意义(P＜0.05);2型糖尿病吸烟组尿白蛋白定量也明显高于2型糖尿病非吸烟组，结果有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 第12周时三组空腹血糖、胰岛素及尿白蛋白比较(±s)

表1 第12周时三组空腹血糖、胰岛素及尿白蛋白比较(±s)

与正常对照组比较:1)P＜0.05;与2型糖尿病非吸烟组比较:2)P＜0.05

组别 n 空腹血糖(mmol/L) 空腹胰岛素(mU/L) 胰岛素抵抗指数 尿白蛋白(μg/dl)20 5.03±0.03 9.44±1.34 2.25±0.08 57.31±5.842型糖尿病非吸烟组 20 9.22±0.041) 21.13±2.171) 8.04±0.281) 284.25±19.731)2型糖尿病吸烟组 20 11.01±0.111)2) 25.65±3.531)2) 12.53±1.561)2) 791.37±9.951)2)正常对照组

2.2 第12周时三组大鼠肾脏组织PCR法检测MK表达 2型糖尿病吸烟组及2型糖尿病非吸烟组MK表达均明显低于对照组。2型糖尿病非吸烟组MK表达较对照组下调4.5倍，2型糖尿病吸烟组较对照组下调10.7倍，结果均有统计学意义(P＜0.05)，且与三组尿白蛋白水平呈显著负相关(相关系数为－0.813，P ＜0.01)。见图1。

1:Marker;2:对照组;3:2型糖尿病非吸烟组;4:2型糖尿病吸烟组

3 讨论

世界范围内，吸烟是人类的一个重要死亡原因〔5〕。吸烟与肿瘤、心脑血管疾病、高血脂、糖尿病等疾病发病均有重要关系〔6～8〕。流行病学调查显示，戒烟成功可降低人群死亡率，但既往吸烟史带来的不良影响仍会持续数年，糖尿病患者表现更为明显〔9，10〕。

吸烟通过多种机制影响糖尿病及其并发症的发生发展，包括胰岛素抵抗、胰岛β细胞损伤、氧化应激等〔11，12〕。吸烟对肾脏的损伤主要包括影响肾脏及全身血流动力学、影响水和电解质排泄、影响近曲小管功能、影响血小板及内皮素的功能等〔13〕。本研究通过高糖高脂饲料喂养及静脉注射STZ诱导方法成功制备出2型糖尿病大鼠模型，并通过测量尿白蛋白定量确定糖尿病肾病。研究发现，实验12 w时2型糖尿病非吸烟组大鼠的尿蛋白定量明显高于对照组，吸烟2型糖尿病大鼠的尿蛋白定量明显高于2型糖尿病非吸烟组和对照组，说明吸烟确实能够促进糖尿病肾病的发生发展。

糖尿病肾病的发病机制非常复杂，与其相关的基因主要包括:与糖、脂代谢相关的基因、与高血压血流动力学相关的基因、与胰岛素敏感性相关的基因、与信号转导相关的基因等。其中肾素－血管紧张素相关基因长期引起人们的关注。MK是一种典型的分泌蛋白，其基因主要在肾脏表达，与多效营养因子共同组成肝素营养因子家族。MK在不同种属间高度保守，人的MK基因位于染色体11q11.2，介于二酰甘油Z基因和毒蕈样乙酰胆碱受体4基因之间〔14〕。人和鼠MK氨基酸序列有87%同源性。研究发现，MK在神经生长、血管生成、肿瘤发生、组织修复等方面具有丰富的生物学功能，近年来研究发现MK参与肾素－血管紧张素系统的调节，通过抑制肾素－血管紧张素系统活性对肾脏起到保护作用〔15～18〕。本研究中第12周时取三组大鼠肾脏组织，PCR法检测MK表达。2型糖尿病吸烟组及2型糖尿病非吸烟组MK表达均明显低于对照组，而2型糖尿病吸烟组较2型糖尿病非吸烟组MK表达减低更加明显，与尿白蛋白定量存在相关性，说明肾脏组织中MK的表达下降与糖尿病肾病的发生发展相关且吸烟加重了这种作用机制。吸烟可能通过减低肾脏组织中MK的表达水平进而影响肾素－血管紧张素系统活性，促进2型糖尿病肾病的进展。已有研究发现，MK可通过蛋白激酶C通路、磷脂酰激醇－3激酶通路及有丝分裂原活化蛋白激酶通路等信号转导发挥作用，也可直接作用于细胞而发挥作用〔17，19〕。下一步研究应关注MK对糖尿病肾病作用的具体机制，为临床治疗提供思路，以及进一步探究吸烟对糖尿病肾病发生发展的作用机制。

通过本研究得出结论，MK在2型糖尿病肾病的发病中发挥作用，吸烟可以通过降低MK的表达进一步加重糖尿病肾病的发展。因此，积极倡导广泛戒烟，养成良好生活方式，对早期预防2型糖尿病肾病发生具有积极意义。

1 Yang SH，Dou KF，Song WJ.Prevalence of diabetes among men and women in China〔J〕.N Engl J Med，2010;362(25):2425－6.

2 Sairenchi T，Iso H，Nishimura A，et al.Cigarette smoking and risk of type 2 diabetes mellitus among middle－aged and elderly Japanese men and women〔J〕.Am J Epidemiol，2004;160(2):158－62.

3 Amin KA，Awad EM，Nagy MA.Effects of panax quinquefolium on streptozotocin－induced diabetic rats:role of C－peptide，nitric oxide and oxidative stress〔J〕.Int J Clin Exp Med，2011;4(2):136－47.

4 Zadeh－Vakili A，Tehrani FR，Hosseinpanah F.Waist circumference and insulin resistance:a community based cross sectional study on reproductive aged Iranian women〔J〕.Diabetol Metab Syndr，2011;3(1):18.

5 Karter AJ，Stevens MR，Gregg EW，et al.Educational disparities in rates of smoking among diabetic adults:the translating research into action for diabetes study〔J〕.Am J Public Health，2008;98(2):365－70.

6 Park SL，Bastani D，Goldstein BY，et al.Associations between NBS1 polymorphisms，haplotypes and smoking－related cancers〔J〕.Carcinogenesis，2010;31(7):1264－71.

7 Luo TY，Lei T，Liu XH，et al.Status quo and factors influencing smoking cessation in cigarette smoking patients with coronary artery disease〔J〕.Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi，2011;39(5):406－9.

8 Yeh HC，Duncan BB，Schmidt MI，et al.Smoking，smoking cessation，and risk for type 2 diabetes mellitus:a cohort study〔J〕.Ann Intern Med，2010;152(1):10－7.

9 MacLeod SL，Chowdhury P.The genetics of nicotine dependence:relation－ship to pancreatic cancer〔J〕.World J Gastroenterol，2006;12(46):7433－9.

10 Chowdhury P，Udupa KB.Nicotine as a mitogenic stimulus for pancreatic acinar cell proliferation〔J〕.World J Gastroenterol，2006;12(46):7428－32.

11 Anan F，Takahashi N，Shinohara T，et al.Smoking is associated with insulin resistance and cardiovascular autonomic dysfunction in type 2 diabetic patients〔J〕.Eur J Clin Invest，2006;36(7):459－65.

12 Xie XT，Liu Q，Wu J，et al.Impact of cigarette smoking in type 2 diabetes development〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2009;30(6):784－7.

13 Boor P，Casper S，Celec P，et al.Renal，vascular and cardiac fibrosis in rats exposed to passive smoking and industrial dust fibre amosite〔J〕.J Cell Mol Med，2009;13(11－12):4484－91.

14 Kadomatsu K，Muramatsu T.Midkine and pleiotrophin in neural development and cancer〔J〕.Cancer Lett，2004;204(2):127－43.

15 Hirota Y，Osuga Y，Koga K，et al.Possible implication of midkine in the development of endometriosis〔J〕.Hum Reprod，2005;20(4):1084－9.

16 Banno H，Takei Y，Muramatsu T，et al.Controlled release of small interfering RNA targeting midkine attenuates intimal hyperplasia in vein grafts〔J〕.J Vasc Surg，2006;44(3):633－41.

17 Hobo A，Yuzawa Y，Kosugi T，et al.The growth factor midkine regulates the renin－angiotensin system in mice〔J〕.J Clin Invest，2009;119(6):1616－25.

18 Ezquerra L，Herradon G，Nguyen T，et al.Midkine，a newly discovered regulator of the renin－angiotensin pathway in mouse aorta:significance of the pleiotrophin/midkine developmental gene family in angiotensinⅡsignaling〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2005;333(2):636－43.

19 Horiba M，Kadomatsu K，Yasui K，et al.Midkine plays a protective role against cardiac ischemia/reperfusion injury through a reduction of apoptotic reaction〔J〕.Circulation，2006;114(16):1713－20.