肌肉免疫DC-EBV-LMP2诱导免疫应答的研究

杜海军 王 湛 尉秀霞 周 玲* 马 晶 冯 霞 叶树清 曾 毅*

（中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所，传染病预防与控制国家重点实验室，北京100052）

树突状细胞（Dendritic cell，DC）是1973年美国洛克菲勒大学的Steinman和Cohn教授从小鼠的外周淋巴器官首次发现的[1]，是体内功能最强的专职抗原提呈细胞（Antigen present cell，APC），也是唯一能激活初始型T细胞的APC，被称为天然“免疫佐剂”，在抗感染、抗肿瘤、移植排斥等过程中发挥重要作用[2]。目前以DC为基础的疫苗在治疗肿瘤方面，尤其在某些晚期肿瘤等的临床治疗方面已经取得一些的成效[3-7]。鼻咽癌（Nasoparyngeal carcinoma，NPC）是我国南方一些省（自治区）的常见恶性肿瘤之一。目前放射治疗是鼻咽癌治疗的基本方法，但中晚期鼻咽癌治疗后常常复发或向远处转移，对于复发和转移的患者在临床上尚无有效治疗方案。EBV-LMP2是NPC细胞表达的病毒抗原之一，是诱导特异性免疫应答的理想靶抗原。以DC为基础的疫苗其免疫方式报道多为静脉回输、淋巴结注射和皮内（下）注射[8-11]。我们以肌肉免疫方式注射DC-EBV-LMP2，研究LMP2诱导的特异性CTL。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Balb/C鼠购自军事医学科学院实验动物中心。优级胎牛血清购自Invitrogen公司。rAd-LMP2：深圳清华源兴生物医药科技有限公司生产。LMP2单抗购于SantaCruz公司；荧光标记羊抗鼠IgG及HRP标记羊抗兔IgG购自北京中衫生物技术公司；流式检测抗体购自Biolegend公司；重组小鼠细胞因子购自Peprotech公司；ELispot Kit购自BD公司；细胞培养液由病毒病预防控制所配液室提供。

1.2 小鼠骨髓细胞分离与DC的诱导培养

断颈法处死小鼠，取出小鼠股骨骨髓，制成成单细胞悬液，以小鼠淋巴细胞分离液（达科为）分离骨髓细胞（2000rpm/min，30min）。洗涤2次（1500rpm/min，10min），获得小鼠骨髓细胞。以4×106/孔浓度接种在6孔培养板中，37℃5%的CO2培养箱中培养3h。轻微晃动培养液，吸掉上清中的悬浮细胞，以无血清1640轻轻冲洗3～4遍，加入含细胞因子（rmGM-CSF200U，rmIL-410U，rmTNF-α100U）10%胎牛血清的RPMI1640，37℃5%CO2培养，3d后，半量更换含细胞因子培养液，继续培养至7d。

1.3 DC-EBV-LMP2制备

用移液管吹打细胞，收集悬浮细胞团，1500rpm/min，离心10min，获得小鼠的DC。以100Tcid50的rAd-LMP2感染吸附DC1小时（体积在0.5～1mL内），然后在含细胞因子（rmGM-CSF200U，rmIL-410U，rmTNF-α200U）10%胎牛血清的RPMI1640作用下，培养48h。第9天收集成熟的树突状细胞（1500rpm/min，10 min）。

1.4 DC表达LMP2的检测：

取5μL DC-EBV-LMP2悬液滴在载玻片的小孔内，晾干后，冷丙酮4℃固定。分别以LMP2单抗（1ı100稀释）、生物素标记标IgG抗体（1∶100稀释）、辣根过氧化物酶标记标抗生物素的IgG抗体（1∶100稀释）与涂片细胞作用（37℃，40min）。每次PBS冲洗3遍。最后将细胞片浸泡于联苯二胺显色液中1min，然后在显微镜下观察LMP2在DC中表达。

1.5 DC-EBV-LMP2免疫Balb/C鼠实验

将Balb/C鼠30只，分为3组，按（表1）的设计进行小鼠免疫。在初次免疫后的第5周和第8周，处死小鼠（每次每组5只），取脾脏分离淋巴细胞进行LMP2特异性细胞免疫检测。

表1 小鼠免疫方案设计

1.6 小鼠IFN-γElispot的检测

按照试BD剂盒使用说明，将包被抗体，以2.5×105/孔接种细胞，LMP2多肽（AAALALLASLIL和ASCFTASVSTVV各2μL/孔）刺激物5μg/mL，设阳性对照1×105/孔（加PHA或ConA刺激1μg/孔）、阴性对照2.5×105/孔、空白对照（加100μL/孔培养液）。按说明书步骤依次加入检测抗体、酶标的链霉亲和素和显色液。用BiosysBioreader4000PRO自动读板仪读取斑点，并作统计分析。

1.7 CD8+T/CD3+T亚群检测

按说明书在淋巴细胞中加入荧光标记CD8和CD3抗体，同时设置阴性对照（空白）、单色阳性对照及多色检测样本，室温孵育20min。PBS洗涤2次，200目滤网过滤后，流式细胞仪检测。

2 结果

2.1 DC制备与LMP2在DC中的表达

在细胞因子诱导下，小鼠骨髓分离的单核细胞逐步分化成树突状细胞。以100 MOI rAd-LMP2感染DC 48h后，免疫酶法可以检测到LMP2在DC中表达（图1）。

图1 LMP2在小鼠骨髓来源DC中表达检测

2.2 DC-EBV-LMP2诱导特异性免疫应答

经过0、2、4周免疫后，用IFN-γElispot法测定LMP2特异性CTL，结果显示DC-EBV-LMP2免疫组特异性CTL（308±167）数量明显高于PBS组（18±6）和DC组（26±12）。统计学分析：P＜0.01具有显著差异（图2）。在免疫后的第8周仍然检测到，只是较第5周有所降低（图3）。

2.3 免疫后细胞亚群变化

以流式细胞仪检测各实验组中CD8+T/CD3+T细胞亚群的比值，数据显示在小鼠0，2，4周免疫后的第5周，DC-EBV-LMP2免疫组CD8+T/CD3+T细胞亚群的比值较PBS和DC组有所升高，但统计学软件分析P＞0.05，不具有统计学意义。而在第八周再次检测CD8+T/CD3+T细胞亚群的比值时是显示，DC-EBV-LMP2免疫组CD8+T/CD3+T细胞亚群的比值低于PBS和DC组。

图2 小鼠0、2、4周免疫后第五周IFN-γElispot检测结果

图3 小鼠免疫后第八周IFN-γ Elispot检测结果

3 讨论

我们以前研究结果表明：以pcDNAⅢ-LMP2真核表达质粒免疫小鼠可诱发LMP2特异性细胞和体液免疫[12]。rAd-LMP2以灌胃、肌肉注射和滴鼻的方式感染小鼠，均可诱发小鼠针对LMP2的特异性体液免疫和细胞免疫[13,14]。EBV-LMP2DNA疫苗、腺相关病毒（adenoassociated virus，AAV）疫苗、非复制5型腺病毒疫苗（Ad5）联合免疫Balb/C小鼠能够更好地诱导机体产生特异性细胞免疫应答[15]。rAd-LMP2肌肉免疫恒河猴可以诱导EBV-LMP2特异性的细胞免疫应答及抗体应答，且免疫应答水平的高低与病毒剂量的高低相关[16]。rAd5F35-LMP2重组腺病毒疫苗在恒河猴体内诱导EBV-LMP2特异性的免疫应答[17]。国内外众多的文献报道，DC的免疫途径有皮下、皮内、淋巴结注射和静脉回输等，未见有肌肉免疫的报道。本研究的实验结果证实DC-EBV-LMP2肌肉免疫小鼠后能够诱导LMP2特异性的细胞免疫应答。由于LMP2刺激产生了较强的细胞免疫应答，生成大量的直接具有杀伤效应的细胞即细胞毒T细胞，造成了免疫后DC-EBV-LMP2组较PBS和DC组的CD8+T细胞亚群有所增高，DC免疫组与PBS组比较也有所升高，可能为DC刺激所致。随着特异性CTL与靶细胞结合后释放穿孔蛋白使靶细胞破裂，免疫应答结束，大部分细胞死亡，微量变成记忆T细胞长期存在。

由于记忆T细胞存在，使我们在第八周仍能够检测到LMP2特异性的免疫应答，虽然随着时间的推移，绝大多数的CTL已经死亡，因而免疫应答强度有所降低，流式细胞仪检测DC-EBV-LMP2组CD8+T细胞亚群比值明显低于其他两组，恰好是一个有力的证据。除此之外，我们注意到免疫后第八周CD8+T细胞亚群水平整体上有所降低，一方面由于小鼠自身CD8+T细胞亚群经过扩增后，除记忆细胞外，其余的大部分凋亡细胞所致，另一个原因可能是不同老鼠实验批次间的差异造成，随着时间延长小鼠“衰老”也可能起一定的作用。在实验中我们未检测CD4+T细胞在小鼠免疫应答过程中的变化，尤其是CD25+CD4+T细胞亚群在特异性细胞免疫应答过程中，起着维持自身耐受和避免免疫反应过度损伤机体的重要作用，也许与CD8+T/CD3+T的比值变化相关。

从我们目前的实验结果分析，虽然DC-EBV-LMP2组诱导的特异性免疫应答的水平明显高于PBS和DC组，但组内小鼠间的数值差异较大，在今后的实验中需要进一步增加每组小鼠的数量，减小鼠间差异。免疫后随着时间的延长，免疫应答的强度衰减，这提示我们在今后的临床免疫治疗中，需要再次免疫或与其它疫苗联合应用来维持细胞免疫的强度。我们正在进行这一方面的探索。

[1] Steinman RM,Cohn ZA.Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice I Morphology quantitation tissue distribution[J].J Exp Med,1973,11(37):1142-1162.

[2] Steinman RM.The dendritic cell system and its role in immunogenicity[J].Annu Rev Immunol,1991,l9(2):271-296.

[3] Nestle FO,Alijagic S,Gilliet M.tumor lysate-pulsed dendritic cells[J].Nat Med,1998,4(3):328-332.

[4] O`Rourke MG,Johnson MK,Lanaqan CM,et al.Dendritic cell immunotherapy for stage Ⅳ melanoma[J].Melanoma Res,2007,17(5):316-322.

[5] Fong L,Brockstedt D,Benike C,et al.Dendritic cell-based xenoantigen vaccination for prostate cancer immunotherapy[J].J Immunol,2001,67(12): 7150-7156.

[6] Yamaquchi Y,Ohta K,Kawabuchi Y,et al.Feasibility study of adoptive immunotherapy dendritic cell-activated killer(PDAK)cells[J].Anticancer Res,2005,l25(3c):2407-2415.

[7] Avigan D,Vasir B,Gong J,et al.Fusion cell vaccination of patients with metastatic breast[J].Clin Cancer Res,2004,10(14):4699-4708.

[8] Mackensen A,Meidenbauer N,Vogl S,et al.PhaseⅠstudy of adoptive T-cell therapy using antigen-specific[J].J Clin Oncol,2006,24(31):5060-5069.

[9] Lambert LA,Gibson GR,Maloney M,et al.Intranodal immunization with tumor lysate-pulsed [J].Cancer Res,2001,61(2):641-646.

[10] Lin CL,Lo WF,Lee TH,et al.Immunization with Epstein-Barr Virus peptide-pulsed dendritic cells induces carcinoma[J].Cancer Res,2002,62(23):6952-6958.

[11] Zuo JM,Zhou L,Chen ZJ,et al.Induction of cytotoxic T lymphocyte responses nasopharyngeal carcinoma[J].J.Microbiol immunol,2006,l4(1):41-48.

[12] 朱伟严,周玲,王琦,等.EB病毒潜伏膜蛋白2DNA疫苗的构建及其初步免疫效果观察[J].中华微生物学和免疫学杂志,2002,22(2):185-190.

[13] 姚佳伟,周玲,王琦,等.EB病毒潜伏膜蛋白2重组腺腺病毒的构建及其免疫效果的研究[J].中国肿瘤,2003,12(1):45-47.

[14] 左建民,周玲,王曾毅,等.含EBV-LMP2基因重组腺病毒疫苗的构建及其诱导CTL应答的初步探讨[J].中华微生物学和免疫学杂志,2003,23(6):446-449.

[15] 杨松梅,王湛,周玲,等.携带EBV-LMP2基因的DNA疫苗、腺相关病毒疫苗和腺病毒疫苗免疫小鼠的特异性细胞免疫应答[J].生命科学,2009,39(4):342-345.

[16] 王湛,周玲,吴小兵,等.Ad-LMP2重组腺病毒疫苗在恒河猴体内免疫效果的研究[J].中华实验和临床病毒学杂志,2006,20(2):63-65.

[17] 莫武宁,周玲,吴小兵,等.rAd5F35-LMP2重组腺病毒疫苗免疫恒河猴诱导免疫应答[J].中华实验和临床病毒学杂志,2007,21(3):226-228.