神经干细胞移植对脑缺血/再灌注损伤大鼠HIF-1α和HIF-3α表达的影响

王 莹，李文媛，刘艳翠，丁 利，赵斯达

(牡丹江医学院解剖教研室，黑龙江牡丹江157011)

低氧诱导因子(hypoxia-inducible factors，HIF)是细胞低氧情况下调控基因表达的主要转录因子之一，主要包括HIF-1α和HIF-3α等亚基，是目前脑缺血缺氧性疾病基因治疗中的研究热点。HIF-1α和HIF-3α可通过促进血管形成、红细胞生成等途径使神经元细胞适应低氧微环境，对神经系统损伤具有保护作用［1］。神经干细胞(neural stem cell，NSCs)是具有自我更新和多向分化能力的细胞，具有易于在体外大量扩增、移植到神经系统后仍可增殖、免疫原性小、能够定向迁移等优点，被广泛应用于神经系统疾病治疗的研究。有文献报道［2］，NSCs移植能够改善脑缺血后的神经功能恢复，但具体作用机制还不清楚。本实验将通过观察NSCs对大鼠脑缺血损伤海马区HIF-1α和HIF-3α表达的影响，以探讨NSCs移植治疗脑缺血/再灌注损伤的可能机制。

1 材料和方法

1.1 动物、药品及试剂 雄性SD大鼠18只，清洁级，体质量280～320 g，购于中国医科大学实验动物中心(许可证号:SYXK［辽］2003-0013)。兔抗大鼠HIF-1α抗体、兔抗大鼠HIF-3α抗体、免疫组织化学SP试剂盒购于北京中山生物试剂公司。PKH-26试剂盒购于美国sigma公司。

1.2 NSCs培养及 PKH26标记 无菌条件下分离出SD大鼠海马组织，参照佟雷等［2］的方法进行分离培养，并换液传代，分离培养取第3～5代的 NSCs，制成单细胞悬液后，参照王莹［3］的方法进行PKH26标记NSCs。

1.3 动物分组与模型制备参照李文媛等［4］的线栓改良法复制大鼠大脑中动脉缺血模型，将18只大鼠随机分为三组:假手术组、模型组、NSCs组，各6只。建模成功后3 h分别经尾静脉注射等体积的生理盐水和已制备好的PKH26标记的同种异体 NSCs悬液(0.5 mL，4 ×106个/mL)，再灌注72 h后取脑，在视交叉后1～4 mm处冠状切面切开，取海马组织。

1.4 神经功能评估 采用李文媛等［4］报道的神经功能损害评分表(neurological severity scores，NSS)从运动、感觉、反射、平衡四方面进行神经功能损害评估，22分为最严重的神经功能损害，即评分越高神经功能损害越严重。

1.5 免疫组织化学检测 严格按照免疫组织化学试剂盒说明书进行操作，其中一抗浓度HIF-1α为1∶80、HIF-3α 为1∶80。以磷酸盐缓冲液代替一抗做阴性对照。阳性率的定量分析:每个标本取4张切片，400倍光镜下每张切片在海马随机选5个视野，用计算机图像分析系统(HPIAS-1000)对各组阳性细胞进行光密度值分析。

1.6 统计学方法 所得数据以采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，数据以均值±标准差(±s)表示，多组均数间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠海马NSCs的原代和传代培养 大鼠海马分离的NSCs生长状态良好，培养第7天时能看到直径约为100 μm的克隆球，克隆球状态良好，球周围附着轮廓清晰的圆形的单个细胞。传代培养细胞增殖较原代快，在传代培养第7天时能形成直径约200 μm的克隆球。

2.2 NSCs移植对神经功能损害的影响 模型组和NSCs组的 NSS 评分分别为(8.43 ±1.45)分和(5.87±1.31)分，前者显著高于后者，两组比较差异有统计学意义。

2.3 PKH-26标记观察 冷冻切片免疫荧光追踪PKH-26标记的移植NSCs，可见NSCs组在海马区有红色荧光信号表达。而假手术组和模型组没有发现红色荧光信号。

2.4 NSCs移植对HIF-1α和HIF-3α的影响 HIF-1α和HIF-3α阳性细胞胞质染色呈棕黄色，阴性细胞的细胞质不着色。假手术组未见HIF-1α和HIF-3α蛋白表达，模型组HIF-1α和HIF-3α蛋白表达较假手术组显著增加。与模型组比较，NSCs组HIF-1α和HIF-3α蛋白相对表达明显上调，差异有统计学意义(P＜0.01)(表1)。

表1 海马区HIF-1α和HIF-3α蛋白表达

3 讨论

HIF是目前治疗脑缺血性疾病的研究热点，可以对缺血缺氧神经元细胞起保护作用，其中HIF-1α和HIF-3α具有诱导血管内皮细胞生长因子、上调葡萄糖载体、抗氧化酶、热蛋白和抗凋亡基因表达，促进神经元细胞生存等生物学功能［1］。本实验发现缺血72 h后模型组HIF-1α和HIF-3α表达较假手术组显著增高，提示HIF-1α和HIF-3α在脑缺血/再灌注早期发挥重要作用，这一结果与以前的研究结果相一致［5］。

NSCs具有多分化的潜能，能自我更新分化成神经元、神经胶质细胞，被认为是改善脑缺血/再灌注损伤的良好种子细胞［2］。本研究发现PKH26标记移植的NSCs在海马区大量存在，而且NSCs移植后大鼠神经功能损伤评分低于模型组，证实尾静脉注射的NSCs能够通过血-脑脊液屏障大量迁移至海马区发挥神经再生作用，促进脑神经功能恢复。有研究表明HIF家族基因在干细胞的发育过程中发挥重要作用，能促进干细胞增殖和分化［6］，而关于干细胞对HIF家族成员表达的影响尚不清楚。本研究发现，NSCs组移植后海马区HIF-1α和HIF-3α的蛋白表达水平明显高于模型组，提示NSCs移植能够通过上调海马区HIF-1α和HIF-3α的表达水平，促进神经功能恢复，但其具体作用机制还有待进一步深入研究。

综上所述，NSCs移植具有促进脑缺血/再灌注损伤后神经功能恢复的能力，其机制可能与其上调海马区HIF-1α和HIF-3α的表达水平有关。

［1］Yuan LB，Dong HL，Zhang HP，et al.Neuroprotective effect of orexin-A is mediated by an increase of hypoxia-inducible factor-1 activity in rat［J］.Anesthesiology，2011，114(2):340-354.

［2］佟雷，季丽莉，解大龙，等.碱性成纤维生长因子和神经生长因子联合应用培养成年大鼠海马神经干细胞向神经元样细胞的分化［J］.中国组织工程研究与临床康复，2011，15(1):74-77.

［3］王莹，李文媛，李明秋，等.黄芪皂甙Ⅳ联合脂肪源性干细胞对老龄大鼠脑缺血再灌注中神经营养因子表达的影响［J］.中国老年学志，2011，31(20):3963-3966.

［4］李文媛，王莹，李明秋，等.黄芪皂苷Ⅳ对大鼠脑缺血/再灌注后海马血管生成的影响［J］.医学综述，2011，6(17):1727-1729.

［5］Lushnikova I，Orlovsky M，Dosenko V，et al.Brief anoxia preconditioning and HIF prolyl-hydroxylase inhibition enhances neuronal resistance in organotypic hippocampal slices on model of ischemic damage［J］.Brain Res，2011，1386:175-183.

［6］Zhu LL，Wu LY，Yew DT，et al.Effects of hypoxia on the proliferation and differentiation of NSCs［J］.Mol Neurobiol，2005，31(1/3):231-242.