人肝癌细胞系MHCC-97H干细胞体外培养及其生物学行为观察

(无锡市第三人民医院，江苏无锡 214000)

据美国卫生部门统计显示，因肝癌而死亡的人数位居肿瘤导致死亡人数的第二位。肝癌的早期症状不明显［1，2］，因此寻找特异性的肿瘤表面标志及分子靶点具有非常重要的意义。肿瘤干细胞被认为是肿瘤始动、复发、转移、耐药的罪魁祸首。自2011年初至今，我们检测了肝癌干细胞及肝癌普通细胞相关标志物的表达差异，探讨肝癌干细胞的生物学行为特点，旨在为其鉴定分选及其生物学特征的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人肝癌细胞系细胞株MHCC-97H(购自中科院上海细胞库)，细胞培养试剂DMEM-F12培养基及胰蛋白酶(购自美国Thremo Fisher公司)，小鼠抗人 CD133Ig，小鼠抗人 Ki67Ig，小鼠抗人MMP9Ig，小鼠抗人MDR1Ig(购自武汉博士德生物工程有限公司)。荧光显微镜。

1.2 细胞培养体系 ①普通培养体系:将MHCC-97H细胞培养于含l0%胎牛血清的DMEM-F12培养基中。②干细胞克隆增殖体系:培养于普通培养体系中的MHCC-97H细胞经磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2遍，将其培养于含10 μg/L碱性成纤维生长因子(bFGF)、20 μg/L 表皮生长因子(EGF)、5 μg/L 胰岛素、2.75 g/L 转铁蛋白、2.75 μg/L 硒的无血清DMEM-F12培养基中，每10天换液1次。将相同来源的MHCC-97H细胞系分别培养于两种培养体系中，放人含5%CO2的37℃恒温培养箱，2 d换液1次。

1.3 观察项目

1.3.1 细胞生长状况及肿瘤细胞表面标志物表达采用免疫荧光法测定。取肝癌干细胞球及对数期肝癌细胞，分别接种于含有5 mL相应培养体系的24孔板中，培养12 h;4%多聚甲醛溶液常温下固定细胞克隆1 h;弃固定液，用PBS漂洗3次，每次15 min;用封闭液于37℃下封闭l h;弃废液，用PBST(0.02 mol/L的PBS中加入0.02%Triton100)漂洗3次，每次15 min;弃废液，加入一抗，37℃下孵育1 h;弃废液，用PBST漂洗3次，每次15 min;弃废液，加入FITC标记二抗孵育2 h及Hoechst 33342，37℃下避光孵育30 min;弃废液，用PBST避光漂洗3次，每次10 min;50%丙三醇封片。荧光显微镜观察细胞生长状况及细胞表面蛋白CD133、细胞核相关抗原(Ki67)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、多药耐药蛋白1(MDR1)表达。

1.3.2 肿瘤细胞内相关蛋白表达 采用Westernblot法测定。收集培养10 d的两组细胞，放入裂解缓冲液中裂解，用Lowry法测定蛋白质含量，电泳后将PAGE凝胶中的蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上，取出后将膜放入3%BSA阻断缓冲液中，封闭60 min，TBS洗 3次，将膜放入一抗中(1∶500稀释)，4℃过夜。TTBS洗3次，将膜放入二抗(1∶500稀释)中，室温孵育1～2 h，用TTBS洗3次，最后用TBS洗膜1次，放入NBT/BC IP显色液中避光显色，直至染色出现，终止反应。将蛋白印迹显影图扫描，利用凝胶自动分析成像软件，对蛋白带进行灰度值分析。以上试验步骤重复3次。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件行统计学处理。组间比较采用独立样本t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MHCC-97H生长状况 干细胞克隆增殖体系中部分细胞不增殖，大部分细胞增殖为半贴壁的细胞球(图-1A)，随着培养天数增加，悬浮细胞球体积逐渐增大，经胰酶消化为单细胞后可再次形成细胞球。在普通培养体系中，细胞贴壁生长(图-1B)。

2.2 细胞表面相关蛋白表达 肿瘤干细胞表面高表达 CD133、MDR1、MMP9，而普通细胞表面未见CD133、MDR1表达，MMP9呈弱表达。肝癌干细胞及普通细胞表面Ki67均呈强表达，干细胞Ki67表达强于普通细胞(图2)。

图1 肝癌干细胞与普通细胞的生长形态

图2 肝癌干细胞和普通细胞表面相关蛋白表达(免疫荧光法)

2.3 细胞内相关蛋白表达 肝癌干细胞中CD133、MMP9、MDR1呈高表达，普通肝癌细胞中未见表达，两组比较有显著性差异，P＜0.05。Ki67在两种细胞内均有表达，普通肝癌细胞表达量高于肝癌细胞，但无显著性差异。

图3 肝癌干细胞与普通细胞内相关蛋白表达(Western-blot法)

3 讨论

近年来研究显示，肿瘤组织中存在一群少量的肿瘤干细胞(在血液系统恶性肿瘤和某些实体瘤中已得到证实)［3］。该群细胞具有自我复制，对放疗和化疗耐受等特征，被认为是肿瘤生长、转移、复发和耐药的基础［4］;可能是导致肝癌早期诊断率低，复发率高，耐药性强的最终原因。

目前分离肿瘤干细胞通常采用侧群细胞分选法、流式细胞分选法及无血清悬浮培养法［5］。本研究采用无血清悬浮培养法从肝癌细胞MHCC-97H系中分离出干细胞，该群细胞呈悬浮半贴壁生长，且体外连续传代10代始终能保持成球的特征;当转换成血清培养时，干细胞球细胞能贴壁生长。据报道，CD133是肿瘤干细胞的表面标志物［6］，本研究中肿瘤干细胞表面CD133呈高表达，既证实该种蛋白可作为肝癌干细胞分选的标志物，亦证实本研究无血清培养的细胞球为肝癌干细胞。

MDR1是一种包括1280个氨基酸，相对分子质量为17000的跨膜磷脂糖蛋白，具有能量依赖性药泵作用。其功能是能主动将进入细胞内化疗药物逆浓度泵出细胞，降低细胞毒性，并使细胞内有效化疗药物浓度下降，从而导致耐药。MDR1介导的肿瘤耐药是化疗失败的主要原因之一。MDR1在白血病干细胞上的表达已有大量报道［7］。但在肝癌细胞是否表达鲜见报道。本研究显示MDR1在肝癌干细胞呈高表达，而在肝癌非干细胞未见表达，因此笔者认为，肝癌干细胞表达的MDR1是介导肝癌发生耐药的主要机制之一;作为肝癌干细胞的特异性膜表达蛋白，MDR1可作为肿瘤干细胞分选的分子标志之一。

MMP9是MMP中分子量最大的酶，存在于细胞质内，以酶原的形式分泌。其分泌到胞外后一方面降解、破坏靠近肿瘤表面的细胞外基质和血管壁的基底膜，促进肿瘤侵袭和转移;另一方面通过毛细血管内生、新生血管生成促进肿瘤侵袭和转移。MMP是高度保守的一类酶，可特异性的降解肿瘤细胞外基质中的蛋白质，是肿瘤细胞向瘤灶周围侵袭性生长的关键酶［8］。本研究发现MMP9在肝癌干细胞内呈高表达，而肝癌非干细胞未见明显表达，据此推测，其介导肝癌转移的主要原因是肝癌干细胞分泌MMP9;激活的MMP9通过降解细胞外基质和血管壁的基底膜，从而促进肿瘤的浸润、转移。其详细机制有待进一步研究。

Ki67是一种与增殖细胞相关的核抗原，与细胞的有丝分裂有关，其存在于细胞周期G1后期及S、G2、M期，与细胞的增殖高度有关［9］。本研究发现，肝癌干细胞及非干细胞内均存在Ki67高表达，说明这两种细胞都具有很强的增殖能力。

总之，肝癌组织中存在着一群肿瘤干细胞，该群细胞是介导肿瘤发生耐药、转移、增殖的主导因素。MDR1为肝癌干细胞的特异性细胞表面抗原，可作为其分选、签定的有效分子标志物。联合多种指标签定、筛选出的肝癌干细胞将对恶性程度极高的肿瘤的治疗产生影响。

［1］Lencioni R，Chen XP，Dagher L，et al.Treatment of intermediate/advanced hepatocellular carcinoma in the clinic:how can outcomes be improved? ［J］.Oncologist，2010，15(suppl 4):42-52.

［2］Morris S.Hepatocellular carcinoma:New and emerging risks［J］.Digest Liver Dis，2010，42(suppl3):S215-222.

［3］Patrick CH，Sonu B，Michele C，et al.Cancer stem cells in solid tumors［J］.Semin Cancer Biol，2010，20(2):77-84.

［4］单魁中，华海清.肝癌干细胞的研究进展［J］.临床肿瘤学杂志，2012，17(3):272-276.

［5］Su FC，Yun CC，Shin N，et al.Nonadhesive culture system as a model of rapid sphere formation with cancer stem cell properties［J］.Plos one，2012，7(2):e31864.

［6］Ma S，Lee TK，Zheng BJ，et al.CD133+HCC cancer stem cells confer chemo-resistance by preferential expression of the Akt/PKB survival pathway［J］.Onco-gene，2008，27(12):1749-1758.

［7］Lim MN，Lau NS，Chang KM，et al.Modulating multidrug resistance gene in leukaemia cells by short interfering RNA［J］.Singapore Med J，2007，48(10):932-938.

［8］Morgan H，Hill PA.Human breast cancer cell mediated bone collagen degradation require splasminogen activation and matrix metallo proteinase activity［J］.Cancer Cell Int，2005，5(1):1-5 .

［9］Yerushalmi R，Woods R，Ravdin PM，et al.Ki67 in breast cancer prognostic and predictive potential［J］.Lancet Onco，2010，11(2):174-183.