卵巢上皮性癌组织中磷酸化蛋白激酶B、PTEN蛋白表达及意义

(邯郸市第一医院，河北邯郸 056002)

卵巢癌尤其是上皮性卵巢癌(EOC)早期即可发生转移，至今其发病机制仍不清楚。近年来研究发现，多种类型的肿瘤包括卵巢癌的发生、发展与信号传导通路异常有关。蛋白激酶B(PKB/AKT)属于丝氨酸/苏氨酸激酶，是一种信号转导蛋白。一旦AKT被激活，它可以磷酸化与细胞凋亡相关的底物蛋白，导致肿瘤发生和化疗耐药。AKT是3-羧基磷脂酰肌醇激酶(PI3K)的一个重要靶基因，二者构成细胞对外应激反应过程中促进细胞生长、抑制细胞凋亡和维持细胞重要功能的信号传递链。与张力蛋白同源的第10染色体丢失的磷酸酶基因(PTEN)是迄今发现的唯一具有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶双重磷酸酶活性的抑癌基因，其表达缺失可使PI3K/AKT信号途径异常活化，从而促进恶性肿瘤的发生［1］。近期我们采用免疫组化方法观察了卵巢上皮性癌组织中p-AKT和PTEN蛋白的表达情况并分析其与卵巢癌临床病理参数的关系，旨在为卵巢癌寻找新的基因治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 标本:选自邯郸市第一医院2008年10月～2010年12月住院患者存档的手术石蜡标本，其中正常卵巢组织10份(正常组，受检者年龄22～58岁，中位年龄40岁);卵巢良性上皮肿瘤组织20份(良性组，患者年龄20～50岁，中位年龄35岁);卵巢上皮癌组织60份(卵巢癌组，患者年龄35～75岁，中位年龄55岁，肿瘤均为初发，术前均未接受过放、化疗)，病理分级:G1 18例，G2 15例，G3 27例;病理分期(国际妇产科联盟1988年标准):Ⅰ、Ⅱ期22例，Ⅲ 、Ⅳ期38例。试剂:兔抗人 p-AKT(ser 473)多克隆抗体(工作浓度1∶50)购自 Cell SignalingTechnology公司;兔抗人 PTEN(工作浓度1∶100)多克隆抗体、DAB显色剂、过氧化物酶标记的链霉卵白素标记盒、试剂盒均购自北京中衫金桥生物技术有限公司。

1.2 p-AKT及PTEN蛋白表达测定 采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶连接(SP)法，每批染色均设阴性和阳性对照。阴性对照采用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗，阳性对照分别取已知p-AKT及PTEN蛋白表达阳性的乳腺癌组织的石蜡切片。结果判断:①阳性细胞比例计分:光学显微镜下随机选取5个视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞数占总细胞数的百分比，取其平均值，阳性细胞比例≤10%为1分，10% ～50%为2分，50% ～75%为3分;≥75%为4分。②阳性细胞染色强度计分:细胞无显色为0分;浅黄色为1分;棕黄色为2分;黄褐色为3分。阳性细胞比例与细胞染色强度积分乘积0分为(－)，1～4分为(+)，5～8分为(++)，9～12分为(+++);积分范围0～12分，≥4分为阳性表达。

1.2.3 相关性分析 分析p-AKT及PTEN蛋白表达与卵巢癌临床病理参数的关系及卵巢癌组织p-AKT与PTEN蛋白表达的相关性。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件行统计学处理。p-AKT和PTEN表达与临床病理参数的关系采用χ2检验，Spearman等级相关法分析二者的相关性。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 p-AKT及PTEN表达 各组p-AKT及PTEN阳性表达率比较见表1。

表1 各组p-AKT和PTEN表达阳性率比较(%)

2.2 p-AKT、PTEN蛋白表达与卵巢癌临床病理参数的关系 见表2。

2.3 卵巢癌组织中p-AKT和PTEN蛋白表达的相关性 p-AKT和PTEN均为阳性表达的标本为7例，在27例PTEN蛋白阳性表达者中7例伴有p-AKT蛋白过度表达，32例p-AKT阳性表达者中7例伴有PTEN过度表达，相关性分析发现，p-AKT和PTEN在卵巢癌组织中的表达呈负相关(r=－0.497，P ＜0.001)。

3 讨论

表2 P-AKT和PTEN蛋白表达与卵巢癌临床病理参数的关系

研究显示，许多信号传导通路与肿瘤的发生发展有关，信号传导通路中癌基因异常活化和抑癌基因失活是影响肿瘤恶性生物学行为及预后的重要因素。近年来临床致力于信号传导通路与恶性肿瘤关系的研究，旨在通过对肿瘤发生、发展分子机制的研究寻找新的治疗靶基因。

PI3K/AKT信号传导通路中某些成分突变所导致的功能获得或缺失能够引起细胞转化，进而调节肿瘤细胞的增殖和存活，并与肿瘤的侵袭、转移行为密切相关。AKT由氨基端的PH结构域、中间的激酶活性区及羧基端的尾部三部分构成。AKT一旦被激活，即可磷酸化部分与细胞凋亡相关的底物蛋白，如 Bcl-2 相关促死蛋白(Bad)、Caspase 9［2］等，在肿瘤发生和化疗耐药等方面扮演重要角色［3］;目前有许多关于AKT可保护细胞不进入编程性死亡的报道［4］。研究发现，PTEN功能缺失可导致PI3K途径的成分如AKT活性增加，而PTEN高表达可通过抑制AKT活性使细胞产生调亡［5］;有报道在卵巢癌细胞中PI3K催化亚单位(P110)扩增可导致AKT变异和PTEN功能缺失［6］，引起细胞抵抗死亡或死亡延迟［7］，从而促进卵巢癌的发生。

本研究卵巢癌组PTEN阳性表达率明显低于正常组;卵巢癌组织中PTEN表达缺失与其对肿瘤细胞生长抑制减弱有关，可促进卵巢癌的发生。本研究结果显示，卵巢癌临床期别越晚、分化程度越低，PTEN阳性表达率越低，即晚期和分化差的卵巢癌中出现PTEN蛋白丢失现象普遍存在;有淋巴结转移和远处转移者PTEN阳性率显著降低，提示PTEN表达水平下降可导致细胞生长失控。研究发现，PTEN除可抑制卵巢癌细胞生长外，还可提高卵巢癌细胞对抗癌基因的敏感性，因此改变PTEN的转录水平可影响PI3K/AKT途径进而抑制肿瘤发生。本研究还发现p-AKT在正常组及良性组不表达或呈弱表达，而在卵巢癌组织中呈高表达 ，提示p-AKT在上皮性卵巢癌的发生、发展过程中起重要作用。临床期别越晚，p-AKT阳性表达率越高，提示p-AKT参与了卵巢癌的发展、浸润和转移;肿瘤分化程度越差，p-AKT的阳性表达率越低，表明AKT活化可促进肿瘤细胞的的恶性增生、转化，进一步说明p-AKT参与了卵巢癌的发展。本研究有淋巴结转移者p-AKT蛋白阳性表达率显著升高，其机制可能为AKT通过激活其底物如增加细胞周期素D转录、磷酸化P21使细胞周期加速，促进肿瘤发展，提示AKT活化与卵巢癌的侵袭、转移有关。p-AKT的表达与年龄、病理类型及有无腹水无关，表明AKT作为细胞生存的一个关键因子，对于肿瘤的形成模式及其诊断、治疗可能具有十分重要的意义。有研究发现从正常到不典型再到恶性转化过程中，p-AKT表达水平逐渐增高，且伴随凋亡相关分子标志物丢失［8］，支持AKT在肿瘤发展中可提高肿瘤生存能力的理论。

本研究结果显示，卵巢癌组织中P-AKT的过表达伴随PTEN的丢失，两者表达呈负相关。PTEN蛋白表达缺失失去了对AKT的抑制作用，使AKT活化，p-AKT过表达，两者共同促进卵巢癌的发展。PTEN使磷脂酰肌醇3磷酸(PIP3)的3’脱磷酸形成PIP2，PTEN表达缺失伴随PIP3水平增高使AKT过度表达，增加了细胞对凋亡的敏感性［9］。Kurose等［10］采用免疫组化和RT-PCR法观察了两者在卵巢癌组织中的关系得出类似结论，与Kanamori在子宫内膜癌中的研究结论一致，本研究结果与此结论亦一致。

分析本研究结果，抑制PI3K/AKT信号通路可能对卵巢癌的治疗具有重要作用。PI3K抑制剂可诱导卵巢癌细胞的程序性死亡，提示阻断PI3K/AKT通路异常激活或恢复PTEN的功能是治疗卵巢癌的有效方法。

［1］Sarbassov DD，Guertin DA，Ali SM，et al.Phosphorylation and regulation of Akt/PKB by the rictor-mTOR complex［J］.Science，2005，307(5712):1098-1101.

［2］Risbud MV，Fertala J，Vresilovic EJ，et al.Nucleus pulposus cells upregulate PI3K/Akt and MEK/ERK signaling pathways under hypoxic conditions and resist apoptosis induced by serum withdrawa［J］.Spine，2005，30(8):882-889.

［3］Levine DA，Bogomolniy F，Yee CJ，et al.Frequent mutation of the PIK3CA gene in ovarian and breast cancers［J］.Clin Cancer Res，2005，11(8):2875-2878.

［4］Brodbeck D，Cron P，Hemmings B，et al.A human protein kinase Bgamm with regulatory phosphorylation sites in the activation loop and in the C-terminal lydrophobic domain［J］.J Biol Chem，1999，274(6):9133-9136.

［5］Obata K，Morland S，Watson R，et al.Frequent PTEN/MMAC mutations in endometroid but not serous or mucinous ePithelial ovarian tumors［J］.Cancer Res，1998，58(12):2095-2097.

［6］Lim S，Clement MV.Phosphorylation of the survival kinase Akt by superoxide is dependent on an ascorbate-reversible oxidation of PTEN［J］.Free Radic Biol Med，2007，42(8):1178-1192.

［7］Bellacosa A，Feo D，Godwin A，et al.Molecular alterations of the AKT2 oncogene in ovarian and breast carcinomas［J］.Int J Cancer，1995，64(4):280-285.

［8］Wang HQ，Altomare DA，Skele KL，et al.Positive feedback regulation between AKT activation and fatty acid synthase expression in ovarian carcinoma cells［J］.Oncogene，2005，24(3):3574-3582.

［9］Brognard J，Clark AS，Ni Y，et al.AKT/Protein kinase B is constitutively active in no-small-cell lung cancer cells and promotes cellular survival and resistance to chemotherapy and radiation［J］.Cancer Res，2001，61(10):3986-3997.

［10］Kurose K，Zhou XP，Araki T，et al.Frequent Loss of PTEN Expression Is Linked to Elevated Phosphorylated Akt Levels，but Not Associated with p27 and Cyclin D1 Expression，in Primary Epithelial Ovarian Carcinomas［J］.Am J Pathol，2001，158(6):2097-2106.