MTHFR基因多态性与法洛四联症的相关性研究

(河南省人口和计划生育科学技术研究院，郑州 450002)

5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(5，10-methylenetetrahydrofolate，MTHFR)是人类同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)代谢途径的关键酶，其能催化5，10-亚甲基四氢叶酸转变为5-甲基四氢叶酸的还原反应。研究发现，MTHFR基因缺陷与心血管疾病发生有关［1］。MTHFR基因突变可导致酶活性降低，但除C677T位点外，人群中MTHFR基因突变发生频率较低［2］。法洛四联症(TOF)是指肺动脉狭窄、室间隔缺损、主动脉骑跨及右室肥厚四种畸形并存的先天性心脏病(CHD)，约占全部CHD的10%，遗传度为55%～65%，其中室间隔缺损和肺动脉狭窄是CHD中最常见的两种畸形。2011年4月，我们对MTHFR基因多态性与TOF的相关性进行了分析，旨在进一步寻找TOF的致病易感基因。

1 资料与方法

1.1 临床资料 根据知情同意的原则，收集河南省胸科医院和郑州市儿童医院经临床表现、彩色多普勒超声心动图诊断的TOF患者136例为观察组，男66例、女70例，年龄6个月～12岁;均排除心脏血管以外畸形，且染色体核型分析无异常。对照组为上述医院同期经临床表现和心脏彩色超声检查排除CHD及其他心脏结构畸形的住院患儿277例，男160例、女117例，年龄3个月～10岁。两组一般资料具有可比性。

1.2 MTHFR基因多态性检测 两组均抽取外周静脉血2 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)-Na2抗凝，置－70℃冰箱中备用;利用常规饱和酚—氯仿抽提法从全血中提取基因组DNA，测定DNA纯度和浓度后－20℃保存备用。MTHFR基因多态性检测步骤:①MTHFR-C677T引物:参照 Frosst等［3］的设计，上游引物5'-TGA AGG AGA AGG TGT CTG CGG GA-3'，下游引物5'-AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG-3'。②PCR 反应体系:总体积 25 μL，其中 ddH2O 18.5 μL，10 × 缓冲液 2.5 μL，10 mM 的 dNTPs 1 μL，12.5 pmol/μL 的引物各 1 μL，DNA 1 μL。③PCR 反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性30 s，58℃复性45 s，72℃延伸45 s，35个循环;72℃终末延伸10 min，最后置于4℃保存。④酶切与酶切产物电泳:10×限制性内切酶反应缓冲液1.0 μL，PCR扩增产物10 μL，限制性内切酶 Hinf I 1 μL，组成12 μL 的酶切反应体系，37℃消化酶切16 h，取出酶切产物。采用3%琼脂糖凝胶电泳，85 V，45 min，最后在紫外凝胶成像系统检测酶切产物及大小，分析基因型。⑤测序分析:扩增产物纯化后送上海生工生物工程有限公司测序，结果采用ClustalX软件与基因库中野生型MTHFR基因序列进行序列对比分析(基因序列号:AY338232.1)。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0软件和Epi Info软件对两组MTHFR基因C677T位点基因型和等位基因频率进行比较，P≤0.05为差异有统计学意义。采用Epi Infor2000软件进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验分析。

2 结果

2.1 酶切及测序 PCR产物为198 bp，野生型677C/C不能被Hinf I酶切，纯合突变型677T/T被Hinf I完全酶切为175 bp和23 bp两个片段(其中23 bp片段由于太短而无法在凝胶上清楚显示)，杂合型677C/T可部分被Hinf I酶切为198、175和23 bp三个片段(其中23 bp片段由于太短而无法在凝胶上清楚显示)，见图1。3种基因型通过DNA测序证实准确，见图2。

2.2 Hardy-Weinberg遗传平衡检验情况 两组MTHFR基因C677T位点基因分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，说明群体基因遗传平衡，数据来自同一孟德尔群体。见表1、2。

图1 MTHFR基因多态性酶切电泳图

图2 MTHFR基因C677T多态性位点3种不同基因型测序结果

表1 对照组MTHFR基因多态性位点遗传平衡检验

表2 观察组MTHFR基因多态性位点遗传平衡检验

2.3 MTHFR基因型构成 观察组共检测出MTHFR基因纯合突变53例(39%)，杂合突变60例(44%)，正常基因型23例(17%);观察组纯合型TT突变频率高于对照组，P＜0.05(χ2=11.89);T等位基因携带者患TOF的风险高于C等位基因携带者(OR=0.553，95%CI为 0.412 3 ～0.741 4)，见表3。

表3 两组MTHFR基因型构成比较［例(%)］

3 讨论

TOF是最常见的紫绀型CHD，是胚胎期动脉干与心球分隔不均而导致的心脏流出道畸形。目前研究结果显示，心脏神经嵴细胞在分化为心脏流出道细胞时若处于高浓度的Hcy环境中，就会改变凋亡相关基因表达，从而不能完成心脏流出道细胞心肌化过程，导致心脏畸形［4］。MTHFR是一种黄素蛋白，由MTHFR基因编码。研究发现，人体MTHFR基因存在29种突变，其中最常见的为C677T突变，即677位核苷酸C→T(丙氨酸→缬氨酸)点突变。这种错义突变使酶的耐热性和活性均降低，可使血浆Hcy水平升高达3倍以上，导致中高度Hcy血症。Hcy可选择性作用于神经外胚层的特定部位，影响神经嵴细胞的分化、迁移、增殖。

本研究显示，两组413例样本中检测得到的MTHFR基因C677T位点多态性与SNP数据库报道一致(http://www.ncbi.nln.nih.gov/SNP/)，其中观察组纯合型TT突变频率和等位基因频率显著高于对照组。提示MTHFR基因C677T位点多态性与TOF存在相关性，即具有T等位基因的个体罹患TOF的风险增高。而Lee等［5］实验结果表明，MTHFR基因多态性与CHD无相关性，特别是TOF。造成上述结果差异的可能原因如下:①MTHFR基因突变导致的Hcy水平变化与体内叶酸水平也存在相关性。虽然Hcy是一种损害心血管发育的危险因素，但是叶酸能有效拮抗Hcy的发育毒性［6］。有充足叶酸摄入且无其他半胱氨酸代谢酶缺陷时，即使存在MTHFR基因突变，Hcy水平也可无变化;叶酸供应缺乏时，MTHFR基因突变则可引起Hcy水平升高［7］。因此，不同地区、种族、人群及叶酸摄入量的差异将影响到相关疾病的发生，在下一步研究中应对这些与MTHFR基因突变相关的因素应进行重点分析。②上述实验的设计不同。本实验采用传统的PCR酶切电泳和直接测序两种方法相对比的实验设计，减少了MTHFR基因C677T位点基因型分析的误差。另外，笔者认为还应在TOF患者中进行MTHFR基因突变筛查和表达分析，以期更深入了解其在TOF发生中的作用。

总之，MTHFR基因 C677T位点基因突变与TOF存在相关性，其可能是TOF的易感基因，但仍需进一步扩大样本进行深入研究。

［1］Wintner S，Hafner E，Stonek F，et al.Association of congenital cardiac defects and the C677T methylenetetrahydrofolate reductase polymorphism［J］.Prenat Diagn，2007，27(8):704-708.

［2］Obermann-Borst SA，van Driel LM，Helbing WA.Congenital heart defects and biomarkers of methylation in children:a case-control study［J］.Eur J Clin Invest，2011，41(2):143-150.

［3］Frosst P，Blom HJ，Milos R.A candidiate genetic risk factor for vascular disease:a common mutation methylenetetra-hydrofolate reductase［J］.Nat Genet，1995，10(1):111-113.

［4］Boot MJ，Steegers-Theunissen RP，Poelmann RE，et al.Cardiac outflow tract malformations in chick embryos exposed to homocysteine［J］.Cardiovasc Res，2004，64(2):365-373.

［5］Lee CN，Su YN，Cheng WF，et al.Association of the C677T methylenetetrahydrofolate reductase mutation with congenital heart diseases［J］.Acta Obstet Gynecol Scand，2005，84(12):1134-1140.

［6］韩树萍，彭宇竹，李静，等.叶酸缺乏对孕鼠子代心脏超微结构及心脏发育相关基因表达的影响［J］.实用儿科临床杂志，2007，22(10):774.

［7］van Beynum IM，Kapusta L，den Heijer M，et al.Maternal MTHFR 677C＞T is a risk factor for congenital heart defects:effect modification by periconceptional folate supplementation［J］.Eur Heart J，2006，27(8):981-987.