牛磺酸对实验性DM大鼠心脏保护作用的研究

张 喆，朱 宁，刘 莉，孙贺英，张永强，刘兰瑞，冯建军

(1河北大学基础医学院，河北保定 071000;2保定市第一中心医院;3河北大学附属医院;4保定市疾病预防控制中心;5保定市第五医院;6临城县人民医院)

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是临床上的常见病、多发病。与非DM人群相比，DM患者各种心脏疾病如心绞痛、心律失常、心力衰竭等的发生率明显增加，且这些并发症也往往是导致患者最终死亡的重要原因。因此，保护DM患者心肌、延缓心肌损伤、防止各种并发症发生对于提高生存质量、延长寿命显得尤为重要。牛磺酸(Taurine)作为人体内条件必需氨基酸，是可兴奋组织(神经、肌肉)细胞内含量最丰富的自由氨基酸。近年来牛磺酸与DM之间的关系受到高度重视。实验研究与临床资料表明，补充牛磺酸对DM神经病变、胰岛素抵抗及心血管并发症具有显著防治作用［1，2］。2011年9月，我们观察了牛磺酸对实验性DM大鼠模型氧化应激损伤及心肌细胞凋亡的影响，旨在进一步探讨牛磺酸对DM大鼠心脏的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠(军事医学科学院实验动物中心)30只，适应性饲养1周;牛磺酸(上海伯奥生物技术公司)，链脲佐菌素(STZ，Sigma公司);葡萄糖试剂盒(中生北空生物科技股份有限公司)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)及大鼠诱导型一氧化氮合酶(iNOS)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)，原位细胞凋亡检测试剂盒(TUNEL试剂盒，Roche公司)等。

1.2 动物分组与处理 将30只Wistar大鼠随机分为对照组(CN组)、DM组、牛磺酸组(TAU组)各10只。其中后两组均一次性尾静脉注射2%的STZ(以pH值4.3的0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲溶液配制)45 mg/kg，继续普通饲料喂养，1周后经内眦静脉采血、以葡萄糖氧化酶法测定血糖，＞16.7 mmol/L者确定为DM制模成功［3］;其后TAU组以牛磺酸(30 g/L)生理盐水溶液300 mg/(kg·d)灌胃，CN组、DM组予等体积生理盐水灌胃，均连续8周。

1.3 血清氧化应激指标检测 1.2实验结束后，三组均用25%乌拉坦4 mL/kg麻醉，腹主动脉取5 mL血液，离心取上清，采用722型可见光分光光度计检测MDA、SOD、NO水平，严格参照试剂盒说明书操作。

1.4 心肌组织iNOS活性及心肌细胞凋亡指数(Apoptotic index，AI)检测 上述实验结束后，三组均取下心脏，一部分心肌组织匀浆后参照试剂盒说明测定iNOS活性。另一部分心肌组织置于15%甲醛中固定24 h，常规石蜡包埋，石蜡切片机常规切片，厚度约5 μm，切片后严格按照TUNEL检测试剂盒说明书进行操作。凋亡细胞的细胞核呈现棕黄色，在普通光学显微镜下即可准确定位，每张切片随机选取6个高倍视野，分别记数凋亡心肌细胞数和心肌细胞总数，以凋亡心肌细胞数占心肌细胞总数的百分比作为 AI［4］。

1.5 统计学方法 采用SPSS16.0软件进行统计学处理。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。方差齐时多组间比较使用LSD法。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 血清MDA、SOD、NO水平 与CN组比较，DM组血清MDA水平明显增加(P＜0.01)，SOD活性显著降低(P＜0.01)，NO水平升高(P＜0.05);与 DM组比较，TAU组血清 MDA水平降低(P＜0.05)，SOD活性提高(P＜0.05)，NO水平降低(P＜0.05)，见表1。

表1 三组血清MDA、SOD、NO水平比较(n=10，±s)

表1 三组血清MDA、SOD、NO水平比较(n=10，±s)

注:与 CN 组比较，*P ＜0.05，△P ＜0.01;与 DM 组比较，#P ＜0.05

组别 MDA(nmol/L) SOD(U/mL) NO(mmol/L)DM 组 8.31 ±1.75△ 0.65 ±0.22△ 109.53 ±20.41*TAU 组 4.09 ±1.18# 2.28 ±1.21# 74.87 ±19.72#CN组1.92 ±0.66 2.86 ±1.37 66.02 ±17.33

2.2 心肌组织iNOS活性与心肌细胞凋亡情况与CN组比较，DM组心肌组织iNOS活性明显增高(P＜0.05)，心肌细胞 AI升高(P＜0.01);与 DM 组比较，TAU组心肌组织iNOS活性降低(P＜0.05)，且心肌细胞 AI降低(P＜0.01)，见表2。

表2 三组心肌组织iNOS、AI比较(n=10，±s)

表2 三组心肌组织iNOS、AI比较(n=10，±s)

注:与 CN 组比较，*P ＜0.05，△P ＜0.01;与 DM 组比较，#P ＜0.05，○P ＜0.01

组别 iNOS(μkat/g) AI(%)DM 组 31.61 ±6.29* 33.52 ±5.74△TAU 组 20.89 ±4.48# 15.49 ±3.53○CN组16.12 ±3.83 4.08 ±1.17

3 讨论

心血管疾病是DM患者最常见的并发症与死亡原因。长期高血糖不仅可引起血管损伤，同时也可直接损害心肌细胞。已有研究证实，高血糖能够触发活性氧族(Reactive oxygen species，ROS)引起氧化蛋白的修饰，增加氧化应激［5］;心肌是受ROS影响的主要器官之一，因此氧化应激在DM心肌损伤中起关键作用。体内的NO是一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)蛋白家族催化生成的具有双向调节功能的气态分子，参与多种生理与病理过程，如低浓度NO可增加心肌收缩力;而高浓度NO可产生负性变时效应，减弱心肌收缩力，增加NO来源的活性氮族(Reactive nitrogen species，RNS)如过氧化亚硝酸盐的形成，产生广泛细胞毒作用，参与组织损伤和疾病的发生。目前研究发现，NOS具有三种异构酶即神经型一氧化氮合酶(Neuronal NOS，nNOS)、内皮型一氧化氮合酶(Endothelial NOS，eNOS)和iNOS，其中eNOS和nNOS在哺乳动物的心肌持续表达;iNOS在正常生理状态下低表达或表达缺陷，仅出现在收缩功能受损时损伤的心肌细胞［6］。本实验发现，与CN组比较，DM组血清MDA水平显著增高、SOD活性明显下降、NO水平升高，心肌组织iNOS活性明显增高;与DM组比较，TAU组血清MDA水平降低、SOD活性提高、NO水平降低，心肌组织iNOS活性明显降低。表明DM大鼠体内脂质过氧化反应明显，氧自由基清除功能下降;DM还可引起iNOS活性增高，促进产生高浓度NO，后者可增加氧化应激形成氧自由基进一步损伤心肌;牛磺酸能够降低iNOS活性、增强SOD活性、减少MDA生成和降低NO浓度。证实牛磺酸具有明显抗氧化、保护心肌的作用。

细胞凋亡是指在一定生理或病理条件下，受基因调控的自身程序性细胞死亡。目前认为，细胞凋亡失调参与许多重大疾病的发病，肿瘤发生、动脉粥样硬化斑块形成等均与细胞凋亡有密切关系［7］。同样，细胞凋亡也是DM心肌破坏的一个重要形式，无论凋亡还是坏死均可导致心肌细胞质量和数量降低，最终损伤心功能，引起心血管系统并发症［8］。本实验显示，与CN组比较，DM组心肌细胞AI显著升高;与DM组比较，TAU组心肌细胞AI明显降低。初步证实牛磺酸可以减少DM性心肌细胞凋亡。此可能继发于其抗氧化功能(体内氧自由基过多可启动细胞凋亡)，即牛磺酸可能通过降低iNOS活性、增强SOD活性减少氧自由基产生，进而抑制凋亡发生。但具体的机制如凋亡相关基因 Bcl-2家族、Caspase家族、癌基因c-myc、抑癌基因p53等的表达变化以及更深层次的机制有待进一步研究。

综上所述，牛磺酸对实验性DM大鼠心脏具有保护作用，可能机制为减轻氧化应激损伤、减少心肌细胞凋亡。

［1］Zulli A.Taurine in cardiovascular disease［J］.Curr Opin Clin Nutr Metab Care，2011，14(1):57-60.

［2］Moloney MA，Casey RG，Fitzgerald P，et al.Two weeks taurine supplementation reverses endothelial dysfunction in young male type 1 diabetics［J］.Diab Vasc Dis Res，2010，7(4):300-310.

［3］Islam MS，Loots du T.Experimental rodent models of type 2 diabetes:a review［J］.Methods Find Exp Clin Pharmacol，2009，31(4):249-261.

［4］Belicza M.Evaluation of morphologically determined apoptotic index［J］.Acta Med Croatica，2009，63(Suppl 2):3-12.

［5］Naudi A，Jove M，Ayala V，et al.Cellular dysfunction in diabetes as maladaptive response to mitochondrial oxidative stress［J］.Exp Diabetes Res，2012，2012:696215.

［6］Carvalho CM，Silverio JC，da Silva AA，et al.Inducible nitric oxide synthase in heart tissue and nitric oxide in serum of trypanosoma cruzi-infected rhesus monkeys:association with heart injury［J］.PLoS Negl Trop Dis，2012，6(5):e1644.

［7］Li J，Ma Q，Liu H，et al.Relationship between neural alteration and perineural invasion in pancreatic cancer patients with hyperglycemia［J］.PLoS One，2011，6(2):e17385.

［8］Lindman BR，Arnold SV，Madrazo JA，et al.The adverse impact of diabetes mellitus on left ventricular remodeling and function in patients with severe aortic stenosis［J］.Circ Heart Fail，2011，4(3):286-292.