一种从富含多糖果实中提取RNA的方法

宋红苗，马 杰，徐祥彬

(杭州师范大学 生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036)

从植物组织中提取纯度高、完整性好的RNA是进行分子生物学方面研究，如 cDNA合成、Northern杂交、mRNA分离、RT-PCR、cDNA文库构建及体外翻译等的必要前提和关键。许多生物材料在提取核酸时，都会遇到多糖的污染问题。多糖的许多理化性质与RNA很相似，很难将它们分开，在去除多糖的同时RNA也容易被裹带走，造成RNA产量的减少。在沉淀RNA时，也容易产生含有多糖的RNA凝胶状沉淀，这种RNA沉淀难溶于水，或溶解后产生粘稠状的溶液。此外，多糖还可以抑制许多酶的活性［1］，因此污染了多糖的 RNA样品无法用于进一步的分子生物学研究。

果实中富含多糖类物质，在提取过程中能与RNA共同沉淀，很难将其分开，从而影响RNA的质量，影响进一步的分子生物学研究。为了能获得高质量的RNA，我们对果实RNA提取技术进行了探索。通过反复探索，我们利用醋酸钾沉淀多糖，结合多次氯仿抽提和LiCl沉淀RNA的方式，得到了一个可以在冬枣、葡萄、甜樱桃、桃、番茄等含不同丰度多糖的果实中适用的RNA提取方法。

1 材料与方法

1.1 材料

供试果实有葡萄，甜樱桃，冬枣，桃子和番茄。

供试生物化学试剂有水饱和酚、氯仿、醋酸钾、Tris碱、70% 乙 醇、SDS、DEPC、NaCl和LiCl。

溶液配制参照分子克隆实验指南第2版。

RNA 提 取 液 配 制:50 mmol·L－1Tris-HCl(pH 值 9.0)，100 mmol NaCl，1%SDS。

1.2 RNA提取和检测

取果实10 g，置液氮中研磨成粉末，转移至经DEPC处理过的50 mL离心管中，然后加入20 mL预热到65℃的水饱和酚/RNA提取液(7 mL水饱和酚，13 mL RNA提取液)，混匀后剧烈振荡10 min，再加入10 mL氯仿，混匀，4℃静置5 min，10 000 g离心20 min，然后取上清液转移至一个新的经DEPC处理过的50 mL离心管，再加入1/3体积醋酸钾(pH值4.8，5 mol·L－1)，混匀，再剧烈振荡5 min，4℃静置30 min，10 000 g离心20 min，再将上清液转移至另一个新的经DEPC处理过的50 mL离心管，加入等体积氯仿，抽提10 min，10 000 g离心30 min(氯仿抽提步骤重复2～3次)。最后取上清液，加入1/3体积的 LiCl(8 mol·L－1)，混匀，于4℃ 放置 12 h以上沉淀RNA，然后4℃下10 000 g离心20 min，弃上清留沉淀，用70%的乙醇洗涤后，吹干沉淀，用适量DEPC处理的ddH2O溶解RNA。

分光光度法检测RNA。分别取1 μL葡萄、冬枣、甜樱桃、桃和番茄的RNA，用Nanodrop分光光度计测定 D260、D280和 D230，通过 D260/D280和D260/D230的比值来检测果实 RNA含量、质量和纯度。

电泳法检测 RNA。分别取2 μL葡萄、冬枣、甜樱桃、桃和番茄的RNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。

2 结果和分析

2.1 分光光度法检测果实总RNA的含量和质量

表1结果表明，用分光光度法在5种含糖量较高的果实中提取的RNA都具有较高的质量和含量。

表1 分光光度法检测的果实总RNA含量和质量

2.2 凝胶电泳检测总RNA的完整性

取2 μL提取的葡萄、冬枣、甜樱桃、桃、番茄RNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，通过凝胶成像可以观测到比较完整的 RNA(图1)，其中28S RNA的亮度大约是18S RNA的2倍。

图1 不同果实提取的RNA凝胶电泳

3 小结和讨论

果实成熟是一个复杂的发育调控过程，伴随着许多生理生化变化，除呼吸上升、乙烯合成、果实软化和色素转变外，糖等风味物质的含量也产生了很大的变化。果实采收前以淀粉的方式积累的碳水化合物，随着果实成熟的进程，被淀粉酶水解成可溶性糖，使其含糖量升高［2－4］。冬枣、葡萄、甜樱桃、桃、番茄等果实含有不同程度的多糖，其中冬枣含有34%～40%的多糖，葡萄含有15%～30%的多糖，甜樱桃含有12%～15%的多糖，桃含有6%～15%的多糖，番茄含有2%左右的多糖。为了在果实中能获得高质量的RNA，有效去处多糖，本文我们对含不同程度多糖的果实RNA提取技术进行了探索。

通过醋酸钾(pH值 4.8，5 mol·L－1)沉淀多糖，再经过3次的氯仿重复抽提，最后经过LiCl(8 mol·L－1)沉淀RNA，结果证明，用该方法提取的果实总RNA完整性好，纯度高，提取的RNA的数量也比较大，可以在1 g果实中提取到大约35 μg左右的总RNA。RNA样品纯度也已达到标准的D260/D280为1.8～2.2和 D260/D230＞1.0，完全可以满足基本的分子生物学实验要求，可以用来进行RT-PCR和Northern杂交。

本方法的优点是先利用醋酸钾(pH值4.8，5 mol·L－1)沉淀多糖，在较低的pH下，高浓度的K+有利于将多糖沉淀至下层，而RNA则保留在上层溶液，从而去除RNA中的部分多糖，并造成上层RNA液相中高浓度的 K+，有利于随后氯仿抽提，进一步去除RNA中的多糖成分。经过以上2个步骤以后，RNA中的多糖成分可以被去除很大一部分，最后再通过 LiCl沉淀可以得到较高质量和数量的RNA。在提取糖含量不同的果实RNA过程中，提取方法可以灵活变化，比如在对含糖量较低的桃和番茄果实RNA提取过程中，我们用醋酸钾(pH值4.8，5 mol·L－1)沉淀多糖后，仅仅经过1次氯仿抽提，然后LiCl沉淀，就可以得到较高质量和数量的RNA。

然而，在提取含糖量较高的果实RNA的过程中，需要多步骤去除多糖，因此提取时间过长(15～19 h)是本方法的1个弱点，容易使得提取过程中的RNA降解，造成RNA提取的失败。因此，在提取RNA过程中，应该尽量使用0.1%DEPC处理过的塑料器皿和高温烘烤过的玻璃器皿，以去除可能存在的RNase造成的影响。

总之，用本方法提取含糖量较高的果实总RNA，排除了多糖的干扰，取得良好的效果。所提RNA可以满足分子生物学试验操作，如RT-PCR和Northern杂交等，为我们进一步研究富含多糖果实采后相关分子机理奠定了重要基础。

［1］Fang G，Hammar S，Grumet R A．Quick and inexpensive method for removing polysaccharides form plant genomic DNA［J］．Biotechniques，1992，13:52 －56．

［2］Hatzfeld W D，Stitt M．A study of the rate of recycling of triosphosphates in heterotrophic Chenopodium rubrum cells，potato tubers and maize endosperm［J］．Planta，1990，180:198－204．

［3］Geigenberger P，Stitt M A．Futile cycle of sucrose synthesis and degradation is involved in regulating partitioning between sucrose，starch and respiration in cotyledons of germinating RicinuscommunisL．seedlingswhen phloem transportis inhibited［J］．Planta，1991，185:81 －90．

［4］王贵禧，韩雅珊，于梁．猕猴桃软化过程中阶段性专一酶活性变化的研究［J］．植物学报，1995，37:198－203．