翅果油树叶片中三萜皂苷的提取工艺研究

2012-07-31张晓俊闫桂琴

浙江农业科学 2012年1期

张晓俊，闫桂琴

(山西师范大学生命科学学院生物多样性研究所，山西临汾 041004)

翅果油树(Elaea gnus．mollis．Diels)属胡颓子科胡颓子属植物，是第四纪冰川作用后残存下来的古生植物，为我国特有种，国家二级重点保护植物［1］。主要分布于山西省乡宁、翼城、平陆等地的低山、丘陵区和陕西秦岭北麓的户县。翅果油树叶片中富含各种营养成分，是一种优良的野生植物资源，具有重要的开发与应用价值。

三萜皂苷在自然界分布很广，并且具有广泛的药理作用和生物活性，如免疫作用、抗氧化、抗肿瘤、抗菌、防治心血管疾病等，而且还可以作为食品天然甜味剂、保护剂、发泡剂、增味剂、抗氧化剂等。目前，三萜皂苷已经广泛应用于药物和食品方面［2］。

本研究通过单因素及正交试验考查了浸提法提取翅果油树叶片中三萜皂苷的主要影响因素，研究了最佳提取工艺条件，期望探索一种快速、简便、提取率高的提取方法。

1 材料和方法

1.1 植物材料

2010年9月于山西翼城甘泉林场采集翅果油树叶片，洗净放置于40℃电热鼓风干燥箱中烘干，经研磨粉碎后过0.177 mm(80目)筛备用。

1.2 仪器和药品

1.2.1 主要仪器及设备

高速万能粉碎机FW100(天津市泰斯仪器有限公司)，电子天平 FA1104(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，HH-8数显恒温水浴锅(江苏金坛市荣华仪器制造有限公司)，D GH-9053A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)，UV-401PC紫外分光光度计(日本岛津)。

1.2.2 主要化学及生化试剂

无水乙醇，正丁醇，香草醛，浓硫酸(均为分析纯)。

77%硫酸溶液:准确量取蒸馏水21 mL于400 mL烧杯中，缓慢加入98%硫酸溶液79 mL，静置后倒入容量瓶中，低温保存。

8%香草醛-无水乙醇溶液:准确称取香草醛8 g于50 mL烧杯中，加无水乙醇溶解，定容至100 mL，置于棕色瓶中，低温保存。

标准品溶液的制备(100 μg·mL－1):准确称取薄层层析得到的三萜皂苷0.025 g，置于100 mL烧杯中，加甲醇使之溶解，定容至250 mL，摇匀密塞，低温保存。

1.3 方法

称取2.0 g翅果油树叶片粉末，用无水乙醇溶液浸提，将提取液进行抽滤，浓缩至浸膏状，加入25 mL蒸馏水复溶，抽滤，滤液再加入正丁醇进行萃取，萃取至正丁醇层无色为止，合并正丁醇层，浓缩至干。采用香草醛－浓硫酸显色法测定含量并计算提取率［3］。

提取率/%=三萜皂苷的质量/翅果油树叶片粉末的质量 ×100。

1.3.1 标准曲线的绘制

准确移取 100 μg·mL－1标准溶液 10 mL，于容量瓶中定容到50 mL，分别取2.00，4.00，6.00，8.00，10.00，12.00 mL于具塞试管中，烘干溶液，加入8%香草醛-无水乙醇液 0.5 mL，1 min后，加入77%硫酸3 mL，摇匀，在75℃恒温水浴中加热5 min，冰水浴15 min，移取1 mL于比色管中加入77%硫酸定容到10 mL，摇匀，10 min后采用紫外分光光度计在440 nm处(比色皿厚度为10 mm)测定吸光值。以试剂空白为参比液，绘制标准曲线。

1.3.2 乙醇浓度对提取效果的影响

称取叶片粉末2.0 g各3份，分别加入30%，45%，60%，75%，90%等浓度不同的乙醇溶液浸提，按1.3的方法得到不同浓度提取剂对提取率的影响。

1.3.3 温度对提取效果的影响

称取叶片粉末2.0 g各3份，分别在40℃，50℃，60℃，70℃，80℃不同温度下浸提，按

1.3 的方法得到不同提取温度对提取率的影响。

1.3.4 料液比对提取效果的影响

称取叶片粉末2.0 g各3份，分别用1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30 不同的料液比浸提，按 1.3的方法得到不同料液比对提取率的影响。

1.3.5 时间对提取效果的影响

称取叶片粉末2.0 g各 3份，分别选择30，60，90，120，150 min不同时间浸提，按1.3的方法得到不同提取时间对提取率的影响。

1.3.6 正交试验

正交试验选择L9(34)正交表，以乙醇浓度、提取温度、料液比、提取时间为4因素，做3水平的正交试验。

2 结果和分析

2.1 最大吸收波长的选择

翅果油树叶片提取物待测液在波长200～600 nm区间吸光值不明显，而经香草醛－浓硫酸显色后有强的吸收峰，最大吸收波长为440 nm，在此位置有明显的峰形，与标准品溶液显色后的扫描曲线相似，本法选用440 nm为测定波长［4］。

2.2 标准曲线的绘制

从图1可以得出以吸光度对三萜皂苷含量求的回归方程是:y=0.103x+0.048 7，相关系数 r=0.996 4。

2.3 乙醇浓度对提取效果的影响

从图2可以看出，随着乙醇浓度的增加，溶液的极性增强，提取率也在增加。乙醇浓度75%时提取率最大，但浓度继续增加反而会使提取率下降。这主要是由于随着乙醇-水体积分数的变化，溶剂的极性发生变化，使一些醇溶性杂质、色素等有机成分溶出量增加。根据相似相溶原理，乙醇浓度达到一定程度时，提取率会下降［5］。

图1 三萜皂苷含量与吸光度的标准曲线

图2 乙醇浓度对提取率的影响

2.4 提取温度对提取效果的影响

从图3中可以看出，随着温度的增加，三萜皂苷溶解度不断增加，但当温度超过70℃时，提取率反而下降。可能是由于温度过高超过溶剂沸点后，容易造成溶剂的损失，使提取率下降;同时温度过高，杂质的溶出量增加，导致提取率下降［6］。

图3 温度对提取率的影响

2.5 料液比对提取效果的影响

由图4知，提取率随乙醇提取剂用量的增加而升高，整个曲线呈现上升趋势。当料液比达到1∶25后，增加的幅度较小。

图4 料液比对提取率的影响

2.6 提取时间对提取效果的影响

由图5可知，随着时间增加，提取率也在增加。当浸提时间超过90 min后，提取率下降。这是因为浸提时间过长，使得部分不稳定的皂苷结构可能发生变化，其他大量非皂苷类的成分也在溶出，可能会结合部分皂苷沉淀［7－10］。

图5 时间对提取率的影响

2.7 正交试验

L9(34)正交试验结果(表1)分析可知，在4个因素中，影响翅果油树叶片中三萜皂苷提取效果的主次顺序为A＞B＞D＞C，提取率最高的条件为A2B3C2D3，即乙醇浓度60%，温度70℃，料液比1∶20，提取时间 120 min。

表1 各处理组合对提取率的影响

3 讨论

本实验以乙醇作为提取溶剂是因为醇提法可以减少药材中水溶性杂质如淀粉、蛋白质和粘液质的浸出，避免三萜皂苷在水溶液中会起泡沫，这样会有定量上的误差。据文献报道，在醇类提取剂中，甲醇的提取率高于乙醇，但甲醇毒性大，且乙醇提取液不会发霉变质，容易回收利用。因此，综合各方面因素，采用醇提法，选择乙醇为提取溶剂。

尽管传统提取法目前在工业生产中应用普遍，但存在提取时间长，有机溶剂损耗多等缺点［10－16］。在传统提取基础上采用超声波或微波等现代辅助提取技术，虽然能有效提高提取率，缩短时间，降低耗能等，但这些技术尚未能在工业生产中大规模使用，考虑到本实验将应用于工业生产的情况，本实验选择浸提法来进行研究。