环境条件对转基因高粱Cry1Ab蛋白含量的影响

卢美贞，崔海瑞

(1.浙江工业大学 化学工程与材料学院，浙江杭州 310014;2.浙江大学原子核农业科学研究所，浙江杭州 310029)

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)在芽孢形成时可产生具有杀虫活性的晶体蛋白［1］，被称为杀虫晶体蛋白或 δ-内毒素［2］。Schnepf等［3］首次成功地克隆了第1个编码Bt杀虫晶体蛋白基因，揭开了利用基因工程培育抗虫转基因植物的序幕。目前它已成为植物抗虫基因工程中应用最广泛的抗虫基因。

浙江大学原子核农业科学研究所首次成功地将来自Bt密码子优化的以玉米泛素为启动子的Cry1Ab抗虫基因转入高粱中［4］，并经农业部批准进入中间试验阶段。转基因高粱的获得为这一作物的品种改良提供了抗虫资源。为有效和合理地利用这一资源，有必要了解不同光照时间、不同温度和不同水平氮肥处理下，Cry1Ab基因在高粱中的表达情况。本研究以转Cry1Ab基因高粱SR16-2和SR24-2为材料，研究不同光照时间、不同温度和不同水平氮肥处理下，Cry1Ab基因在高粱中的表达特性。

1 材料与方法

1.1 材料

研究所用的材料为高粱原受体亲本115R及其转入Cry1Ab基因的2个稳定转化株系，这2个株系处于 R5代，编号分别为 SR16-2和 SR24-2，它们分别来自2个独立转化株，系采用农杆菌介导法培育而成［4］。

1.2 处理设计

1.2.1 光照处理

取SR16-2和SR24-2株系干种子各100粒，进行常规浸种、催芽，种子萌动后放在人工培养室28℃恒温下培养，设3次重复，每重复20粒种子，设置的光照时间分别为 10，12，14，16和18 h，待幼苗长到3叶期时，各处理随机取幼苗(去根)5个测Cry1Ab蛋白含量。

1.2.2 温度处理

取SR16-2和SR24-2株系干种子各100粒，进行常规浸种、催芽，种子萌动后放在光照培养箱中培养，每日相同光强光照12 h，设计了5个温度水平，分别为20，25，30，35和40℃，湿度在75%左右，设3次重复，每重复20粒种子，待幼苗长到3叶期时，各处理随机取幼苗(去根)5个，测Cry1Ab蛋白含量。

1.2.3 施氮水平处理

取SR16-2和SR24-2株系干种子各100粒，进行常规浸种、催芽，萌动后将种子播种于网室，分别设置 4个基肥纯氮水平，0，300，450和600 kg·hm－2，进行常规栽培，在拔节期各处理分别随机选5株取叶片测Cry1Ab蛋白含量。

1.3 Cry1Ab蛋白测定

以上所取样品洗净后称重，在液氮中磨成粉状，放入离心管中，按4 μL·mg－1的比例加适量蛋白提取缓冲液(试剂盒随带)，充分混匀后置于4℃浸提3 h，5 000 r·min－1离心 5 min，上清液或其稀释液即可用于测定。将100 μL样品提取液加入到已包埋好抗体的96孔板中，同时加入不同浓度(0，0.5，2.5，5.0 ng·mL－1)的 Cry1Ab蛋白标准溶液，按 Cry1Ab/Cry1Ac板式试剂盒(美国ENVIROLOGIX公司)提供的方法进行测定，最后根据酶标仪(SpactronMax190，德国)在波长为450 nm下D的读数，参照标准曲线和提取液稀释倍数计算出各器官组织Cry1Ab杀虫蛋白含量，以样品中所含的Cry1Ab蛋白含量来表示(ng·g－1)，测定时各设3次重复。

2 结果与分析

2.1 不同光照时间对Cry1Ab蛋白量的影响

对不同光照长度处理的Cry1Ab蛋白含量测定结果如图1。

图1 不同光照时间下转基因高粱幼苗中Cry1Ab蛋白含量

由图1可见，在10，12，14，16和18 h等不同光照时间处理后，2个转基因株系的Cry1Ab蛋白含量平均分别为 1.05，2.10，1.40，1.94和1.67 ng·g－1，以光照12 h时的 Cry1Ab蛋白含量最高，光照10 h的表达量最低，二者相差1倍以上，表现趋势为12 h＞16 h＞18 h＞14 h＞10 h，且2个转基因株系表现出相同的趋势。说明光照长度对Cry1Ab蛋白表达量具有一定的影响。

2.2 不同温度处理对Cry1Ab蛋白量的影响

对Cry1Ab蛋白含量测定结果显示，不同温度处理对 Cry1Ab蛋白含量也有较大影响(图2)。25℃培养时叶片中 Cry1Ab蛋白含量最高，达到2.24 ng·g－1，温度升高，Cry1Ab蛋白含量呈现下降趋势，40℃最低，只有0.44 ng·g－1，20℃时叶片中Cry1Ab蛋白含量比35℃略高。可见温度也是影响Cry1Ab蛋白表达水平的一个重要环境因素。

图2 不同温度处理下转基因高粱幼苗中Cry1Ab蛋白含量

2.3 不同施肥水平对Cry1Ab蛋白量的影响

图3是对不同施氮水平下Cry1Ab蛋白量的测定结果。当以 300，450，600 kg·hm－2不同施氮水平作基肥处理时，SR16-2转基因高粱株系叶片中的Cry1Ab蛋白含量比未施基肥的对照分别显著提高85.40%、48.66%和12.90%;在另一转基因高粱株系SR24-2中，施肥后的Cry1Ab蛋白含量与对照相比差异更大，分别提高了200.42%，50.42%和39.58%。结果表明，施肥可以促进Cry1Ab蛋白的合成，作基肥的以300 kg·hm－2纯氮效果最佳。

图3 不同施N基肥量下转基因高粱Cry1Ab蛋白含量

3 小结与讨论

Bt蛋白含量的高低直接影响着转 Bt基因植物的抗虫效果，而环境因素对Bt基因的表达起着重要的调节作用［5］，尤其是当 Bt基因处于诱导型启动子控制下时，这种影响更为突出。因此，阐明环境因素对Bt基因表达水平的影响对转Bt基因植物的合理栽培与利用具有重要的指导作用。本研究的结果表明，光照、温度和氮肥对Cry1Ab蛋白表达量都具有明显的影响，为转Cry1Ab基因高粱的进一步应用提供了理论依据。

温度对外源基因的表达起着重要的调节作用［6］。Takimot等［7］曾报道玉米泛素启动子的表达不受系统调节，而是受独立的对热击或物理胁迫产生反应的细胞调节，在受胁迫情况下，该启动子会改变它的表达特性。此外，Meyer［8］也曾报道过温度会影响转基因矮牵牛中35S启动子的甲基化。本研究所用转基因高粱中的Cry1Ab基因是由玉米泛素启动子驱动的，研究结果显示，温度对转基因高粱Cry1Ab蛋白含量有较大的影响，高温不利于Cry1Ab蛋白的表达，这与吴刚［9］对玉米泛素启动子控制的Cryab在转基因水稻中表达量受温度调节的研究结果相一致，都证明了 Takimoto等［7］的结论，也与夏兰芹等［10］报道棉花中35S启动子引导的Bt基因所表达的杀虫蛋白量在高温胁迫后急剧下降的结果相似。此外，在转Bt基因棉花中也有因气温反常导致抗虫性下降的报道［11］。因此，在转Bt基因抗虫植物的种植过程中，应根据温度预报情况加强监测，在高温期到来之际综合采用其他防治措施。

合理施肥是作物栽培管理的关键。施肥直接促进根系对氮素等养分的吸收，进而影响植株体内蛋白质的合成。在转Bt基因棉花中，王家宝等［12］报道追肥可提高叶片中的Bt蛋白含量，且随追肥量的增加而增加;周冬生等［13］也报道随追肥量的增加转Bt基因棉抗虫性增强。本研究结果表明，施氮基肥有助于Cry1Ab蛋白含量的提高，但是随着施氮量的增加Cry1Ab蛋白含量并未呈现增长的趋势，反而有所下降。由此可见，作基肥与追肥的效果不同。因此，对转Bt基因抗虫植物的施肥，不但要控制氮肥的量，还应讲究施肥方式。

光照直接影响着植物的生长、发育。有关光照对转基因表达的影响，在转玉米A1基因的矮牵牛中已有报道［7］，但光照是否影响 Bt基因在转基因植物中的表达水平尚未见报道。高粱属短日照植物，临界光周期约为12 h。本研究中发现光照12 h时转基因高粱叶片中的Cry1Ab蛋白量最高，光照长于或短于这一时间均导致Cry1Ab蛋白含量的降低。因此，要获得较好的抗虫效果，在种植转Bt基因高粱时应从光照长度这一角度考虑其合适的地域。

［1］Hannay C L．Crystalline inclusions in aerobic spore-forming bacteria［J］．Nature，1953，172:1004．

［2］Hannay C L．The protein crystals of Berliner［J］．Can J Microbiol，1955，1:694 －710．

［3］Schnepf H E，Whiteley H R．Cloning and expression of the Bacillus thuringiensis crystal protein gene in Escherichia coli［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1981，78:2893－2897．

［4］张明洲．农杆菌介导高梁转化体系的建立与 Bt(Bacillus thuringiensis)抗虫基因的导入［D］．杭州:浙江大学，2002．

［5］Sachs E S，Benedict J H．Pyramiding Cry1A(b)insecticidal protein and terpenoids in cotton to resist tobacco budworm［J］．Environmental Entomology，1998，25(6):1257－1266．

［6］周桂生，周福才，谢义明，等．温度胁迫对转 Bt基因抗虫棉毒蛋白的表达和棉铃虫死亡率的影响［J］．棉花学报，2009，21(4):302－306．

［7］Takimoto I，Christensen A H，Quail P H，et al．Non-system expression of a stress-responsive maize polyubiquitin gene(Ubi-1)in transgenic rice plants［J］．Plant Molecular Biology，1994，26:1007－1012．

［8］Meyer P．Endogenous and environmental factors influence 35S promoter methylation of a maize Al gene construct in transgenic petunia and in color phenotype［J］．Molecular and General Genetic，1994，6:1410－1414．

［9］吴刚．cry1Ab基因在转基因水稻中的遗传、表达与沉默［D］．杭州:浙江大学，2000．

［10］夏兰芹，郭三堆．高温对转基因抗虫棉中 Bt杀虫基因表达的影响［J］．中国农业科学，2004，37(11):1733－1737．

［11］Kaiser J．Pests over whelm Bt cotton crop［J］．Science，1996，223:423－427．

［12］王家宝，王留明，沈法富，等．环境因素对转 Bt基因棉Bt杀虫蛋白表达量的影响［J］．山东农业科学，2000，(6):4－6．

［13］周冬生，吴振廷，王学林等．施肥量和环境温度对转 Bt基因棉抗虫性的影响［J］．安徽农业大学学报，2000，27(4):352－357．