MicroRNAs与可卡因成瘾关系的研究进展*

王芬芬，沈 杰，张吉翔，3△

(南昌大学1第二附属医院消化内科，2第二附属医院教学管理办公室，3江西省分子医学重点实验室，江西 南昌 330006)

可卡因进入体内会导致海马、前额叶皮层、中脑腹侧被盖区及伏隔核等学习记忆相关脑区的多巴胺、谷氨酸、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)等神经递质释放的异常变化，通过作用于相应的受体引发一系列分子事件:包括激活细胞内信号转导通路，改变神经营养因子、转录因子、即刻早期基因或染色体的结构等，并最终引起突触的可塑性，甚至神经元的形态结构发生变化，从而导致成瘾形成。

近年来研究发现，过度摄取可卡因后将诱导一类微小RNAs(microRNAs，miRNAs)转录或翻译水平的改变，这一分子事件对可卡因成瘾的形成具有重要调节作用，包括促进和抑制作用。深入研究miRNAs与可卡因成瘾形成之间的内在联系及具体调节机制，将为治疗可卡因成瘾提供一条全新的途径。本文就miRNAs的结构、分布、功能及不同miRNAs在可卡因成瘾形成过程中的具体调控机制等作一综述。

1 miRNAs的结构、分布及功能

miRNAs是一种长度为18～24核苷酸单链的内源性非编码小RNA，在进化过程中高度保守，通过与靶基因mRNA的3'非编码区(3'-untranslated region，3'UTR)的结合位点(miRNA binding site)结合，在转录后水平调节基因表达，参与细胞增殖、凋亡、分化、代谢、发育等多种生物学过程［1］。miRNAs可以从多个层面发挥调控基因表达的作用:(1)与靶基因3'UTR结合，抑制靶基因的翻译;(2)与靶基因3'UTR结合，引起靶基因mRNA的降解;(3)诱导基因组特定区域组蛋白的甲基化，从而调控基因转录活性。人大约有1000多个miRNAs［2］，研究分析表明，人类绝大多数基因受miRNAs的调控［3-4］。哺乳动物神经系统中存在大量的miRNAs，其中约有70% 可在脑组织中表达;神经系统中miRNAs呈现出高时序性、高保守性和高特异性的表达方式，参与调控神经系统的生长发育、神经元分化、突触可塑性及高级神经功能(如生物钟、记忆、学习)等［5］。最新研究发现，miRNAs可以改变某些可卡因成瘾相关基因的表达、减弱或增强可卡因产生的奖赏效应，从而调控可卡因成瘾的形成。目前已经发现的与可卡因成瘾相关的miRNAs有:miR-212、miR-132、miR-124、let-7d、miR-181a及 Ago2 依赖型 miRNAs(Ago2-dependent，induced by cocaine and Drd2-enriched miRNAs，ADICD miRNAs)等，它们通过多种途径参与可卡因成瘾的调控过程。

2 miRNA与可卡因成瘾

2.1 miR-212、miR-132与可卡因成瘾 miR-212位于人类第17号染色体短臂17p13.3-D片段上，主要分布于纹状体、伏隔核区、海马区、中脑腹侧被盖区以及小脑等处［6］。已经发现的100多个miR-212靶基因中，与可卡因成瘾相关的有Sprouty相关细胞膜蛋白(Sprouty-related with EVH1 domain-containing protein 1，SPRED1)基因［7］。miR-132 是与 miR-212受同一顺式调控元件控制，从同一个多顺反子转录前体加工成熟的miRNA;它们在基因组上呈串联排列，成簇分布［8］。

Hollander等［7］发现急性可卡因给药会诱导大鼠纹状体中miR-212和miR-132表达上调，表明miR-212和miR-132与可卡因成瘾有一定关系。随后他们进行了更深入的研究，结果显示:与短时用药(1 h 0.5 mg/kg每天自身给药)训练和正常对照组相比，长时用药(6 h 0.5 mg/kg每天自身给药)反复训练会导致大鼠截然不同的行为表现以及某些基因表达水平的差异。如长时可卡因用药训练大鼠行为上表现出可卡因摄入量随训练次数增加而增加，而短时用药训练大鼠可卡因摄入量始终保持恒定水平，前者的总摄入量也明显高于后者;同时，长时用药训练大鼠觅药动机比短时用药组和对照组大鼠更高;此外，长时给药训练组大鼠纹状体中miR-212和miR-132的表达明显升高，表达量约为1.4倍短时训练组以及1.75倍对照组。用反义寡核苷酸特异性减少大鼠纹状体中miR-212的表达不影响miR-132的表达，发现长时给药训练组大鼠可卡因摄入量明显增加，而短时给药训练组和对照组大鼠可卡因摄入量无明显差异;此时，长时给药训练组大鼠对可卡因的渴求明显高于短时给药组和对照组。以上结果提示我们，只有当机体摄入一定剂量可卡因后，所产生的奖赏效应才足以刺激纹状体中的miR-212和miR-132过度表达。随后的研究发现，miR-212是通过放大cAMP反应序列结合蛋白 (cAMP-responsive element binding protein，CREB)信号途径而发挥其抗可卡因成瘾的功能。

1987年，Montminy等发现有一种分子量约为43 kD的蛋白质可与生长抑素基因的cAMP反应元件(cAMP response element，CRE)有高度亲和力，于是命名为CREB。CREB是cAMP通路下游的一种核转录因子，具有DNA结合结构域和转录激活结构域，分别与它们的DNA结合活性和转录调节活性有关。其转录激活结构域中133位的丝氨酸残基可被蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、Ca2+/CAM 依赖性激酶、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)等磷酸化，磷酸化的CREB可参与cAMP诱导的多种靶基因的转录调控;在神经系统中，CREB可能介导神经递质诱导的基因表达，并能通过放大神经营养因子的信号，参与神经细胞增殖分化、存活等生物效应［9］。CREB还是一种调控可卡因奖赏作用的负性调控因子，其功能和表达的降低与可卡因奖赏效应及戒断后的抑郁症状密切相关［10］。大量研究证实，控制情绪反应的中脑边缘多巴胺系统是与药物成瘾密切相关的奖赏系统中枢所在，而中脑腹侧背盖区(ventral tegmental area，VTA)和伏隔核(nucleus accumbens，NAc)更是关键区域。VTA的主要传出纤维在NAc与中等大小棘突状神经元形成突触联系，分2路投射至中脑黑质网状区和苍白球(旧纹状体)。脑源性神经营养因子(brain-derived neurophic factor，BDNF)与其受体酪氨酸激酶B(tyrosine kinase receptor B，TrKB)结合后［11］，激活 NAc 的有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路，进而促进CREB磷酸化。磷酸化的CREB一方面促进NAc内强啡肽的分泌:强啡肽与VTA上κ-阿片受体结合后，负性调节VTA中多巴胺的运输，使突触间隙多巴胺减少，从而减弱可卡因产生的奖赏效应［12］;另一方面，磷酸化的CREB诱导纹状体中miR-212和miR-132过表达，过表达的miR-212反过来进一步放大CREB信号途径，从而协同CREB发挥抗可卡因成瘾作用［7］。

miR-212放大CREB信号途径的主要机制有:(1)miR-212提高胞内cAMP的水平，cAMP通过2条途径放大CREB信号:包括a)G蛋白(guanylate binding protein，鸟苷酸结合蛋白)→腺苷酸环化酶(adenylate cyclase，AC)→cAMP→PKA 途径，即 cAMP-蛋白激酶途径［13-14］，PKA被 cAMP激活后，催化 CREB 133位丝氨酸残基磷酸化，从而激活CREB;b)CREB活性调控因子或CREB辅助因子(transducer of regulated CREB activity，TORC)途径:虽然CREB能和靶基因结合并激活表达，但有时激活效应活性较低;TORC是调节CREB活性的转导蛋白，它能与CREB相互作用协调发挥激活效应［15-16］。cAMP通过诱导TORC乙酰化减少TORC降解［17］，从而提高胞内TORC，尤其是TORC2的水平，最终放大CREB/TORC级联效应。(2)miR-212激活Raf蛋白:Raf蛋白家族包括:Raf、B-Raf和 Raf-1［18］。一方面，活化的 Ras/raf蛋白激活细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)［19］，激活后的 ERK 通过磷酸化激活一系列细胞膜表面以及细胞质、细胞核内的类似核糖体S6蛋白激酶(ribosomalprotein S6 kinase，RSK)的蛋白激酶底物，并与之共同入核的方式促进CREB磷酸化;这就是Ras/Raf/MEK/ERK信号级联通路，又称ERK通路，是一条可被广泛激活的MAPK通路［18-20］。另一方面，活化的Raf-1蛋白通过激活各亚型的AC，提高胞内cAMP水平［21］，再经cAMP-蛋白激酶途径激活CREB。miR-212靶基因SPRED1是抑制Raf-1信号途径的关键基因［22］，对ERK通路有一定的阻遏作用。miR-212下调SPRED1的转录和翻译水平，从而解除其对ERK通路的抑制，见图1。

Figure 1.miR-212 pathway in cocaine-induced synaptic plasticity.miR-212 is up-regulated in the dorsal striatum of rats with a history of extended access to cocaine.Striatal miR-212 decreases responsiveness to the motivational properties of cocaine by markedly amplifying the stimulatory effects of the drug on cAMP response element-binding protein(CREB)signalling.This action occurs through miR-212-enhanced Raf-1 activity，resulting in adenylyl cyclase sensitization and increased expression of cAMP and the essential CREB co-activator TORC.图1 miR－212调控可卡因成瘾途径

2.2 miR-124与可卡因成瘾 miR-124是脑组织中表达最为丰富的一类miRNA，约占脑组织miRNA总量的25%～48%。miR-124在分化神经元和成熟神经元中大量表达。将miR-124转染到HeLa细胞中发现，HeLa细胞的基因组表达模式向神经方向转化，miR-124能使神经细胞的特性得以获得并维持［23］。研究还发现，miR-124可以与超过1100个基因的基序相结合，并能抑制100多个基因的表达［23］，CREB和神经元限制性沉默因子(RE1 silencing transcription factor，REST)就是其靶基因之一;miR-124与CREB、REST的3'UTR结合位点结合后，将抑制它们的翻译过程从而减少两者的表达。反复给予可卡因后，机体产生一种负反馈调节以对抗可卡因成瘾，即神经突触释放大量神经递质如5-HT，5-HT经ERK通路抑制miR-124的表达，进而促进CREB、REST以及BDNF等的表达［24］，并最终调控可卡因成瘾的形成过程。

2.3 与可卡因成瘾相关的其它miRNAs Chandrasekar等［24］运用逆转录定量 PCR(qRT-PCR)技术，发现长时反复给予可卡因可诱导中脑边缘多巴胺能神经元miR-124和let-7d表达下调，而miR-181a表达上调，提示let-7d、miR-181a与miR-124一样，参与可卡因成瘾过程的调控。它们主要通过影响转录调控因子［如CREB、转录阻遏子(transcriptional repressor)nucleus accumbens-1(NAC-1)、period2(Per2)蛋白、REST、BDNF、神经递质受体(多巴胺受体、阿片类受体)以及信号蛋白MAPK4和磷脂酰肌醇4激酶2β(phosphatidylinositol 4-kinase type 2 beta，PI4K2β)］的表达水平，多途径调控可卡因诱导产生的神经可塑性改变，见图2。Eipper-Mains等［25］发现腹侧纹状体中高表达的miRNAs，如miR-8家族，通过一些微调途径如影响神经递质的代谢和多肽类激素的分泌，可促进药物如可卡因诱导的神经可塑性改变。已知中脑边缘多巴胺通路，尤其是腹侧纹状体的神经可塑性改变是参与成瘾药物奖赏作用的重要神经机制之一［26］;由此说明，miR-8家族也是调节可卡因成瘾过程的miRNAs之一。

2.4 ADICD miRNAs 近年来，研究人员仍在不断探索更多与可卡因成瘾相关的miRNAs及其调控机制，为治疗可卡因成瘾提供新靶点。不久前，Schaefer等［27］发现给予野生型大鼠大剂量可卡因后，可诱导多巴胺受体2(dopamine receptor D2，Drd2)神经元内的63种miRNAs高表达，其中23种是argonaute 2(Ago2)依赖型miRNAs，又称ADICD miRNAs;Ago基因编码Ago 1、2、3和4蛋白，只有Ago2蛋白能够抑制其靶基因ADICD miRNAs的表达［28］。高表达的 ADICD miRNAs在可卡因成瘾形成过程中起促进作用，可能与其抑制抗可卡因成瘾相关靶基因的表达有关。如:miR-18/23(CREB)、miR-3/23(Fos)、miR-6/2(FosB 3)、miR-3/23［细胞增强因子-2(myocyte enhancer factor 2，Mef2)］、miR-1/23(BDNF)以及 miR-369-3p(Mef2、FosB)［27］。但 ADICD miRNAs调控可卡因成瘾形成的具体途径和分子机制尚不清楚，有待进一步研究。

3 结语

Figure 2.miR-124，let-7d and miR-181a pathway in cocaine-induced synaptic plasticity.Several microRNAs affect the expression of many cocaine-regulated gene.The brain-enriched miR-124 is suppressed by chronic cocaine in the mesolimbic dopaminergic pathway(presumably by the induction of REST)，which induces expression of miR-124 target genes(BDNF，NAC-1，etc.)favoring the formation of addictive phenotype.Downregulation of let-7d results in induction of its target genes(DA-D3R).In contrast，miR-181a(also a brain-enriched miRNA)is markedly induced by cocaine，causing downregulation of its targets(PI4K2B，Per2 and RGS4).Study strongly supports the hypothesis that miR-124，let-7d and miR-181a are involved in a dynamic double-negative feedback loop，thereby regulating the differential expression of various genes in response to cocaine，which may result in the molecular adaptation leading to addiction.图2 miR－124、let－7d和miR－181a调控可卡因成瘾途径

目前miRNAs调节可卡因成瘾的作用还远未被研究清楚，我们的认识可能只是冰山一角。到底有多少miRNAs参与了可卡因成瘾的调控，其中又有哪些起促进作用，哪些起抑制作用，具体调控机制如何，这些问题还有待进一步深入研究。鉴定新miRNAs及其靶标在可卡因成瘾患者体内的表观遗传学改变，以及其生物功能和药理学的利用价值等可能成为今后一段时间miRNAs治疗药物成瘾研究的重要内容。有人提出是否可以使用人工合成的miRNA寡核苷酸链(synthetic miRNA oligonucleotides)直接改变体内的miRNA表达水平，从而作为新型治疗工具在包括可卡因在内的多种药物成瘾的治疗中得到广泛应用。总之，对miRNAs更深入的研究可望有助于解决包括可卡因在内的药物成瘾治疗的难题。

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