STAT3和SOCS3与子宫内膜异位症的相关性研究*

涂飞霞，阮 菲， 吴瑞瑾，詹 宏， 马俊彦，林 俊

(浙江大学医学院附属妇产科医院妇产科，浙江 杭州 310006)

子宫内膜异位症(内异症)是一种常见的良性妇科疾病，多见于育龄期妇女，其引起的痛经、盆腔疼痛、不孕等问题严重影响妇女的生活质量和生育能力［1］。内异症虽然是一个良性疾病，但具有类似肿瘤的恶性生物学行为如增殖、侵袭及复发等［2－3］。Janus激酶/信号转导与转录活化因子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)信号通路与细胞分化、增殖、侵袭和凋亡密切相关，并受细胞因子信号抑制因子(suppressor of cytokine signaling，SOCS)的负反馈调节。STAT3和 SOCS3是 STAT家族和SOCS家族的重要成员，研究发现在多种肿瘤中存在着STAT3的过度活化和SOCS3表达的减少或缺失［4］。内异症异位病灶的形成与肿瘤转移非常相似，需要异位子宫内膜细胞的黏附增殖、细胞外基质的降解、新生血管生成以及抵抗机体免疫清除等过程。目前STAT3和SOCS3在内异症中的表达尚未见报道，我们分别检测了内异症患者异位、在位子宫内膜组织和非内异症患者子宫内膜组织中STAT3、磷酸化STAT3和SOCS3在蛋白水平的表达情况，以揭示STAT3和SOCS3与内异症的相关性。

材料和方法

1 材料

1.1 标本 85例组织标本收集自2011年3～4月在浙江大学医学院附属妇产科医院行手术治疗的患者。30例异位子宫内膜组织(异位组，n=30)取自行卵巢子宫内膜异位囊肿剥除术患者，并经病理确诊为卵巢子宫内膜异位症，年龄(37.7±6.7)岁，根据r－AFS分期，Ⅰ/Ⅱ期有2例，Ⅲ/Ⅳ期28例。30例在位内膜组织(卵巢子宫内膜异位症患者的子宫内膜，在位组，n=30)取自内异症患者行子宫切除或刮宫术者，年龄(41.5±6.7)岁，疾病分期处于Ⅰ/Ⅱ期有4例，Ⅲ/Ⅳ期26例。25例对照子宫内膜组织(对照组，n=25)取自因纵隔子宫、子宫肌瘤、伴有输卵管疾病的不孕症行腹腔镜检查及手术的患者，并经腹腔镜观察未患子宫内膜异位症，年龄(40.8±6.5)岁。3组患者年龄比较差异无统计学意义(P＞0.05)，在位和对照子宫内膜处于增殖期或分泌期依照病理检查结果分期，异位内膜所处月经周期根据患者末次月经时间以及血清雌孕激素水平判断。所有入选者均无内外科伴发疾病，有规律月经周期(28～32 d)，手术前3个月内未接受激素及其它药物治疗、未放置宫内节育器。实验经本院伦理委员会审批通过，标本收集前均签署本人知情同意书。组织标本经冰PBS清洗后立即放入液氮中，于－80℃冰箱中保存备用。

1.2 主要试剂 组织蛋白裂解液(成分:20 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，1%Triton X －100，sodium pyrophosphate，β － glycerophosphate，EDTA，Na3VO4，leupeptin，1 mmol/L PMSF)(碧云天)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京鼎国)，0.45 μm聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)(Pall Life Sciences)，ECL发光液(Biological Industries)，兔多克隆抗人SOCS3抗体、兔多克隆抗人STAT3抗体、兔多克隆抗人p－STAT3抗体(Tyr705)(Cell Signaling Technology)，鼠单克隆抗GAPDH抗体(Santa Cruz Technology)，辣根过氧化物酶标记的抗兔、抗鼠Ⅱ抗(Cell Signaling Technology)。

2 方法

Western blotting检测STAT3、p－STAT3和SOCS3蛋白表达。取50 mg组织匀浆裂解提取蛋白质，BCA试剂盒测定蛋白浓度。取100 μg总蛋白在10%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离后转至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入兔抗 SOCS3、p－STAT3、STAT3和鼠抗 GAPDHⅠ抗(分别稀释 1∶1000、1∶1000、1∶2000、1∶2000)4 ℃孵育过夜，室温孵育相应的抗兔、抗鼠Ⅱ抗(分别稀释1∶4000，1∶5000)1 h，应用ECL发光液，在ImageQuant LAS 4000 mini下曝光显影。用ImageQuantTL 7.0软件分析条带灰度值，以GAPDH为内参照，比较3组SOCS3、STAT3分别与GADPH的灰度值比值，以及p－STAT3与STAT3灰度值比值评价STAT3活化程度。

3 统计学处理

结 果

1 STAT3及其活化形式p－STAT3在3组内膜组织中的表达

单因素方差分析显示总STAT3蛋白的表达在3组中无显著差异(P＞0.05)，而其活化形式Tyr705位点磷酸化的STAT3与总STAT3比值(p－STAT3/STAT3，即STAT3活化水平)呈现明显差异(P＜0.01)。两两比较显示异位组p－STAT3/STAT3与对照组(P＜0.01)和在位组(P＜0.01)的差异均有统计学意义，而在位组与对照组之间差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1、图1。对照组中分泌期STAT3磷酸化水平高于增殖期(t=－3.864，P＜0.01)，而在位组(t=－0.681，P＞0.05)和异位组(t= －0.024，P＞0.05)中则不随月经周期变化，见图2。各组年龄在35岁及以上与年龄35岁以下者比较，p－STAT3/STAT3和总STAT3表达差异均无统计学意义(P＞0.05)。异位组中痛经患者与无痛经患者p－STAT3/STAT3表达无显著差异(P＞0.05)。

2 SOCS3蛋白在3组子宫内膜组织中的表达

SOCS3蛋白在对照组中表达最高，在位组其次，异位组最低，见表1、图1。3组间比较差异有统计学意义(P＜0.01)，异位组与对照组(P＜0.01)和在位组(P＜0.01)比较差异均有统计学意义，对照组与在位组比较无明显差异(P＞0.05)。各组SOCS3蛋白的表达与月经周期无关(P＞0.05)，年龄大于等于35岁与小于35岁者SOCS3蛋白表达也无显著差异(P＞0.05)。异位组中痛经患者与无痛经患者SOCS3表达比较无显著差异(P＞0.05)。

Figure 1.The activation level of STAT3 and the expression of SOCS3 protein in the three groups..*P＜0.05 vs control group;△P＜0.05 vs the eutopic group.图1 STAT3磷酸化活化水平与SOCS3蛋白表达

Figure 2.The activation level of STAT3 in the proliferative and secretory phases of different groups..*P＜0.05 vs the corresponding proliferative phase.图2 STAT3磷酸化活化水平与月经周期的关系

3 STAT3磷酸化活化水平与SOCS3蛋白相关性分析

比较内异症患者在位和异位内膜标本中SOCS3及STAT3磷酸化水平，发现SOCS3表达与p－STAT3/STAT3比值呈负相关(r=－0.499，P＜0.01)。

讨 论

STAT3广泛表达于各种组织和细胞，磷酸化活化后形成二聚体从细胞质进入细胞核，调控靶基因如细胞周期素D1(cyclin D1)、血管内皮生长因子(VEGF)、bcl－xL和 bcl－2等的表达，促进细胞生长、抵抗凋亡、血管生成及侵袭［5］。本研究结果显示异位内膜中STAT3的磷酸化活化水平明显高于在位和对照内膜，提示异位子宫内膜存在STAT3的过度活化。内异症患者腹腔液中多种促炎性细胞因子如白细胞介素6(IL－6)、肿瘤坏死因子α(TNF－α)等分泌增多，而这些细胞因子是JAK/STAT3通路重要的激活因子，可能是引起异位子宫内膜细胞STAT3过度活化的原因之一。STAT3参与调节子宫内膜的蜕膜化，对受孕起重要作用，Dimitriadis等［6］发现p－STAT3在分泌期的子宫内膜腺上皮和间质细胞表达明显高于增殖期。在对照子宫内膜，我们观察到分泌期STAT3磷酸化水平明显高于增殖期;而在内异症患者的在位和异位内膜中，STAT3磷酸化水平不随月经周期变化，提示内异症患者STAT3的活化异常可能与在位和异位子宫内膜细胞蜕膜化分化能力异常［7］有一定的联系，这些细胞因不能正常分化而表现出增殖能力增强，与异位病灶的形成和发展密切相关。

表1 各种蛋白在3组中的表达Table 1.Expression of different proteins in the three groups()

表1 各种蛋白在3组中的表达Table 1.Expression of different proteins in the three groups()

*P ＜0.05 vs the control group;△P＜0.05 vs the eutopic group;#P ＜0.05 vs the corresponding proliferative phase.

SOCS3(SOCS3/GAPDH)Total STAT3(STAT3/GAPDH)Activation of STAT3(p－STAT3/STAT3)Control(n=25)1.475 ±0.7890.749 ±0.408 0.541 ±0.243 0.919 ±0.601 Proliferative(n=14) 0.882 ±0.293 0.592 ±0.332 Secretory(n=11) 0.579 ±0.480 1.336 ±0.618#Eutopic(n=30) 0.623 ±0.220 0.678 ±0.271 0.979 ±0.416 Proliferative(n=19) 0.646 ±0.205 0.939 ±0.424 Secretory(n=11) 0.584 ±0.250 1.047 ±0.413 Ectopic(n=30) 0.263 ±0.156 ＊△ 0.684 ±0.317 1.471 ±0.738＊△Proliferative(n=18) 0.297 ±0.177 1.468 ±0.725 Secretory(n=12)0.211 ±0.103

SOCS3基因被描述为一种潜在的肿瘤抑制基因，它通过对JAK/STAT、局部黏着斑激酶(FAK)及促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)等途径的负性调控而发挥抗肿瘤细胞生长、迁移等作用［4，8］。SOCS3基因启动子含有 STAT3结合位点，受活化的STAT3诱导表达，并反馈抑制STAT3的活性。本研究发现在异位内膜中SOCS3蛋白表达明显低于对照和在位内膜，异位内膜中过度活化的STAT3并没有诱导SOCS3表达相应的上升，提示在内异症中可能存在某些因素导致SOCS3蛋白下调，使其对多种信号的负反馈调节功能减弱，包括STAT3。在异位子宫内膜细胞，受促炎症细胞因子激活的STAT3由于缺乏SOCS3的负反馈调节而处于持续过度活化状态，进而引起细胞增殖和侵袭能力增强，故我们推测两者的共同作用可能参与内异症的发病。在正常子宫内膜细胞中，SOCS3对JAK/STAT等通路的负反馈处于平衡状态，协调细胞的多种生物学行为。而在内异症患者的在位子宫内膜，其SOCS3蛋白表达与对照内膜无差异，可能是内膜细胞逆流入腹腔后，在腹腔内环境的作用下出现多种信号通路活化异常、基因表达异常等，导致SOCS3蛋白表达下降，并进一步参与异位病灶的形成和发展。至于SOCS3表达异常的原因以及参与调控的信号机制都需要进一步深入探讨。

本次研究首次证实在子宫内膜异位症患者的异位子宫内膜组织中，存在STAT3的过度活化和SOCS3蛋白表达的下调，为我们探讨内异症发生发展的机制提供了新思路，下一步我们将从细胞分子水平研究STAT3活化及SOCS3下调的机制，为内异症的治疗及新药研发提供一种新的策略。

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