一种IFN-γELISPOT检测方法的建立

刘培培 王洪芳 吕 品 王少雄 (上海泽润生物科技有限公司分析制剂室，上海201203)

酶联免疫斑点(Enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)技术是20世纪80年代中期出现，并逐渐发展和完善起来的一种能够从单细胞水平检测特异性抗体分泌细胞和特异性细胞因子分泌细胞的免疫技术，具有较高的稳定性、敏感性和特异性。目前，该技术已经广泛应用于疫苗和药品的检测、自身免疫疾病的检测、病毒以及肿瘤研究、结核病高危人群的筛查以及各种免疫性疾病的研究和检测［1，2］;干细胞功能分析;B细胞杂交瘤检测，药物免疫学反应和抗原表位肽的筛选等。国家药审中心要求:“在评价细胞免疫效价时，应当建立检测评价细胞免疫的方法(如特异性CTL反应的方法或ELISPOT方法等”。IFN-γ是由Th1细胞亚群分泌的一类细胞因子，能够促进CTL、NK细胞及巨噬细胞的活化和增殖介导的细胞毒效应。因此建立IFN-γELISPOT检测方法，可以作为检测和评价疫苗细胞免疫的有效方法。虽然ELISPOT技术已经被广泛应用于机体免疫功能的测定，但是该技术尚未完全标准化，其阳性判定标准各不相同，因此在ELISPOT方法建立与应用过程中，这方面仍需要进一步的探讨。

本文以本公司自制的融合蛋白疫苗，免疫C57BL/6小鼠，从免疫途径、免疫剂量、细胞浓度以及肽刺激浓度等方面确立了检测该融合蛋白疫苗诱导的特异性IFN-γ的ELISPOT方法，为该疫苗的细胞免疫研究提供了一种准确、灵敏、特异的检测方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要实验材料 C57BL/6小鼠，6～8周龄，雌性，SPF级，上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物生产许可证号:SYXK(沪)2008-0058;无热原的融合蛋白疫苗、样品稀释液(无热原的空白佐剂溶液)由本公司制备;淋巴细胞分离液、无血清培养基为达科为公司产品;RPMI1640、FBS为Gibco公司产品;刀豆蛋白(ConA)为Sigma公司产品;Mouse-IFN-γ ELISPOT kit、AEC kit为 BD 公司产品;刺激肽为上海生工合成产品，纯度＞95%。

1.2 方法

1.2.1 小鼠免疫 将C57BL/6小鼠随机分为实验组和对照组，实验组腹部皮下注射疫苗，注射量为0.5 ml/只，免疫浓度为 30 μg/ml，对照组每只注射0.5 ml的样品稀释液，14天后，加强免疫一次。

1.2.2 脾淋巴细胞分离 C57BL/6小鼠加强免疫14天后，摘眼球取血并处死，无菌取脾，置于3 ml淋巴细胞分离液中，在200目的筛网中研磨成单个细胞悬液，转移细胞悬液至15 ml的离心管中，在细胞悬液上轻轻覆盖一层1640培养基，2 000 r/min离心30分钟，吸取淋巴细胞层，用无菌PBS溶液清洗2次，无血清培养基重悬细胞，台酚蓝染色并进行细胞计数。

1.2.3 ELISPOT实验步骤 按照试剂盒说明书要求，稀释捕获抗体，100μl/孔，4℃包被过夜。次日倾倒包被液，无菌PBS洗涤3遍，再用含10%FBS的1640培养基进行封闭，200μl/孔，室温封闭2小时;弃封闭液，加入脾淋巴细胞，100μl/孔，实验孔加入刺激肽，阴性对照孔中不加刺激物，ConA作为阳性对照，37℃、5%CO2培养箱中刺激培养一段时间;倾倒培养基，以200μl/孔冰冷的去离子水，4℃冰浴20分钟裂解细胞;用PBST洗板4次，加入检测抗体，100μl/孔，室温避光孵育1小时;PBST洗板4次，加入酶标亲和素，100μl/孔，室温避光孵育1小时;用PBST洗板3次、再用PBS洗板2次，加入底物显色液，100μl/孔，室温下避光显色15～20分钟;去离子水终止色反应，CTL S5 Versa斑点分析仪进行斑点计数。

1.2.4 ELISPOT 方法的建立

1.2.4.1 免疫途径的选择 将C57BL/6小鼠随机分为6组，每组7只，比较3种免疫途径，分别为皮下注射、肌肉注射、腹腔注射，给药量为0.5 ml/只，免疫浓度为30μg/ml，各免疫途径相应的对照组每只注射0.5 ml的样品稀释液。14天后，加强免疫一次，于第28天，颈部脱臼处死小鼠，无菌取脾，分离淋巴细胞，计数，将脾淋巴细胞浓度调整至3×106个/ml，100 μl/孔种于 ELISPOT 板，加入刺激肽，1μg/孔，于37℃、5%CO2培养箱中刺激培养40小时后，进行ELISPOT检测。

1.2.4.2 细胞培养时间的选择 随机抽取实验组小鼠、对照组小鼠各5只，无菌取脾，分离淋巴细胞，计数，将脾淋巴细胞浓度分别调整至3×106个/ml，100μl/孔种于 ELISPOT板，加入刺激肽，1μg/孔，阴性对照孔不加刺激物，置于37℃、5%CO2培养箱中刺激培养，于12、24、48和72小时，进行ELISPOT检测。

1.2.4.3 细胞浓度的选择 随机抽取实验组小鼠5只，无菌取脾，分离淋巴细胞，计数，将脾淋巴细胞浓度分别调整至2 ×106、3 ×106、4 ×106、5 ×106、6 ×106个/ml，100 μl/孔种于 ELISPOT 板，加入刺激肽，1 μg/孔，阴性对照孔不加刺激物，于37℃、5%CO2培养箱中刺激培养40小时后，进行ELISPOT检测。

1.2.4.4 特异性肽刺激浓度的选择 随机抽取实验组、对照组小鼠各5只，无菌取脾，分离淋巴细胞，计数，将脾淋巴细胞浓度调整至4×106个/ml，100 μl/孔种于ELISPOT板，用培养基对刺激肽进行稀释，按照 0.125、0.25、0.5、1、2、4 和 8 μg/孔的刺激量分别加入，于37℃、5%CO2培养箱中刺激培养40小时后，进行ELISPOT检测。

1.2.5 融合蛋白疫苗诱导的细胞免疫效应检测

将C57BL/6小鼠随机分为6组，每组8只，其中5组为实验组，另外一组为对照组。将疫苗用样品稀释液进行梯度稀释，浓度分别为:120、30、7.5、1.8和0.46μg/ml，分别按组给药，每个浓度为一组，注射量为0.5 ml/只，对照组每只注射0.5 ml的样品稀释液。14天后，加强免疫一次，于第28天，颈部脱臼处理动物，无菌取脾，分离淋巴细胞，计数，将脾淋巴细胞浓度调整至4×106个/ml，100μl/孔种于ELISPOT 板，加入刺激肽，1 μg/孔，于37℃、5%CO2培养箱中刺激培养40小时后，进行ELISPOT检测。

2 结果

2.1 ELISPOT试验结果分析 图1中的每一个斑点代表一个分泌IFN-γ的T淋巴细胞(Spot forming cell，SFC)，斑点数与该孔细胞总数的比值即为分泌IFN-γ的T淋巴细胞比率，该比率的高低反映着机体的IFN-γ水平和机体细胞免疫效应的强度。

阳性判断标准:参考文献［3-5］并结合本研究的实际情况，设定抗原刺激孔的斑点数大于55个斑点/106个细胞，且大于4倍的阴性对照孔的斑点数。每个实验组中阳性小鼠的只数与每组小鼠总数的比值为免疫阳转率，该比率的高低反映该疫苗细胞免疫强度。

2.2 动物免疫途径的确定 由图2结果可知，在30μg/ml免疫浓度下，皮下注射免疫效果最佳，平均斑点数最多，腹腔注射次之，而肌肉注射免疫效果不佳，3种免疫方式相应的对照组，均呈阴性反应。从3种免疫途径的比较结果看，选择皮下注射作为该疫苗的最佳小鼠免疫方式。

2.3 细胞培养时间的确定 由图3的结果可知，在刺激肽的作用下，实验组小鼠特异性分泌IFN-γ的脾淋巴细胞数随着培养时间的增加而递增，对照组小鼠非特异性分泌IFN-γ的脾淋巴细胞数在48小时前无明显变化，维持在一定水平，但在48小时后显著增强，达到40多个斑点。在无刺激肽作用下，实验组小鼠分泌IFN-γ的脾淋巴细胞数随着培养时间的增加呈现一定的递增趋势，但幅度很小，最高可到12个/孔;对照组小鼠则无明显变化，一直维持在5～10个/孔。由此可知，在刺激肽作用下，细胞培养时间控制在24～48小时范围内比较合适。

2.4 细胞浓度的确定 由图4可知，斑点数随着脾淋巴细胞浓度的增加而增加，当脾淋巴细胞浓度为4×105个/孔时，实验组小鼠脾淋巴细胞形成的特异性斑点数平均达到75个/孔，对照组小鼠脾淋巴细胞形成的非特异性斑点数较少，平均斑点数为12个/孔，本底干扰小。当脾淋巴细胞浓度小于3×105个/孔时，斑点数太少，小于20个/孔，实验误差就会增大;当细胞浓度大于4×105个/孔时，对照组小鼠脾淋巴细胞形成的非特异性斑点数逐步升高，大于40个/孔，本底干扰大，影响结果判断。所以最佳细胞浓度为4×105个/孔。

图1 IFN-γELISPOT斑点形成照片Fig.1 Spot forming pictures of IFN-γ ELISPOT

图2 不同免疫途径下小鼠细胞免疫强度比较Fig.2 Effects of different immunization routes

图3 培养时间对IFN-γ分泌的影响Fig.3 Effects of culture time on the IFN-γ secretion

图4 脾淋巴细胞浓度对IFN-γ分泌的影响Fig.4 Effects of cells concentration on the IFN-γ secretion

图5 肽刺激浓度对IFN-γ分泌的影响Fig.5 Effects of peptide concentration on the IFN-γ secretion

表1 融合蛋白疫苗诱导的细胞免疫量效关系检测结果Tab.1 The results of the fusion protein vaccine-induced cellular immune response

图6 疫苗诱导的细胞免疫强度量效关系Fig.6 Dose effect relation of the fusion protein vaccine

2.5 肽刺激浓度的确定 由图5可知，在0.125～2μg/孔的肽刺激浓度范围内，实验组小鼠形成的特异性斑点数随肽刺激浓度的增加而增加，当肽刺激浓度为4μg/孔，斑点数减少;而对照组小鼠的非特异性斑点数随着肽刺激浓度的增加一直维持递增的趋势，通过综合比较，肽刺激浓度选择0.5～2μg/孔的范围比较合适，实验选择1μg/孔作为最佳肽刺激量，在此浓度下，实验组小鼠特异性分泌IFN-γ的脾淋巴细胞形成的斑点数较多，而对照组小鼠形成的非特异性斑点较低，本底干扰较小。

2.6 融合蛋白疫苗诱导的细胞免疫效应检测 随着疫苗免疫浓度的逐渐增加，特异性分泌IFN-γ的T淋巴细胞形成的斑点数也逐渐增加，当免疫剂量为30μg/ml时，平均斑点数最高，阳转率也最大，达到75%;当浓度继续升高时，平均斑点数有所减少。由于动物个体差异以及动物机体对于药物的敏感程度各有差异，所以同组间小鼠特异性分泌IFN-γ的T淋巴细胞形成的斑点总数有一定的差异，组间偏差较高，结果见表1。对照组小鼠均呈阴性反应。将免疫浓度取Log值，用Graphpad prism软件进行Log免疫浓度-阳转率的剂量曲线拟合，结果见图6，曲线拟合参数 R2＞0.95，EC50值为 6.6 μg/ml，曲线拟合较佳，根据EC50值的大小，可以评价该融合蛋白疫苗的细胞免疫强度。

3 讨论

近年来，在免疫学研究领域中，对于疾病以及疫苗研究不仅仅局限于体液免疫应答，细胞介导的免疫应答也逐渐为人们所关注。在研究细胞免疫应答保护作用及其机理方面，酶联免疫斑点法(ELISPOT)是近几年发展起来的一项非常实用的细胞免疫学检测技术，它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术(ELISA)的长处，能够分析经特异性抗原活化后分泌细胞因子(如 IFN-γ、TNF-α等)的单个效应细胞的频数，具有敏感性高，易操作，特异性好的优点，能从2×105～3×105细胞中检出1个分泌细胞因子的细胞，实验证明其敏感性比ELISA法高10～200倍［6］，这些独特优点都使得 ELISPOT技术成为国际公认的检测抗原反应性效应细胞的实验方法之一。

本研究通过对免疫途径、脾淋巴细胞浓度、细胞孵育时间、抗原刺激浓度等条件的摸索，建立了一种由本公司自制的融合蛋白疫苗诱导的特异性细胞免疫的IFN-γELISPOT检测方法，用以评价该融合蛋白疫苗诱导的细胞免疫应答效应。实验通过比较皮下、腹腔、肌肉三种注射方式的免疫效果，选择皮下注射方式作为该疫苗的最佳小鼠免疫方式;合适的脾淋巴细胞浓度直接影响结果的判断，细胞浓度过低时，形成的斑点数量少，使检测的敏感度降低，过高的细胞浓度又会导致背景太深，非特异性干扰增加影响斑点计数，综合考虑，本研究选择4×105个/孔作为脾淋巴细胞铺板浓度;细胞孵育时间的长短是本研究重要的影响因素之一，合适的细胞孵育时间既要满足检测的敏感度，又要排除非特异性斑点的干扰，通过实验比较本研究选择24～48小时作为脾淋巴细胞孵育时间;抗原刺激浓度是另一个重要的实验影响因素，本研究选择针对该融合蛋白疫苗特异性刺激肽作为抗原刺激物，经过实验结果的综合比较选择0.5～2μg/孔作为该肽段的刺激浓度范围，在该浓度范围内，实验组小鼠特异性分泌IFN-γ的脾淋巴细胞形成的斑点数较多，而对照组小鼠形成的非特异性斑点低，本底干扰小。以系列梯度稀释的融合蛋白疫苗对小鼠进行免疫，从实验结果中可知，当免疫剂量为30μg/ml时，免疫组小鼠脾淋巴细胞经过抗原刺激后，形成的平均斑点数最高，阳转率也最大，以Log免疫浓度-阳转率进行曲线拟合，可得EC50值，根据EC50值的大小，可以评价该融合蛋白疫苗的细胞免疫强度。

在ELISPOT数据分析方面，常选用两种分析方法进行结果处理，其中一种为通过比较不同免疫组的平均斑点数的多少，判断药物细胞免疫强度;另外一种方法是选择合适的阳性判断标准，计算阳转率来评价药物细胞免疫强度。本文对两种数据处理方法进行了比较，当采用平均斑点数进行数据分析时，如果组间小鼠个体差异不大时，结果具有可比性，但是如果同组中有1～2只小鼠给药后应激反应较为强烈，形成较多的特异性斑点，这种个体差异将会导致平均斑点数大幅度提高，增加了结果的变异性，影响组间结果的判断。然而采用阳转率进行数据分析时，则可以避免因为机体个体差异而导致的实验误差和结果判断的不准确性。因此，选择一个合适且严谨的阳性判断标准非常重要，一定要结合实验自身的情况进行大量数据分析，经过统计分析比较后，再进行选择。

本文建立的ELISPOT方法能够用于检测该融合蛋白疫苗诱导的特异性IFN-γ，评价疫苗的细胞免疫效应，该方法操作简单，能够从单细胞水平上进行细胞因子的检测，是一种高效、灵敏、特异的免疫学检测方法。

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