siRNA-ΔNp63干扰质粒在体外对HeLa细胞迁移和侵袭能力的影响

邹家琼 杨国珍 敬 鹏 罗昭逊

1.贵阳医学院医学检验系，贵州 贵阳 550004；2.川北医学院检验系，四川 南充 637000；3.川北医学院附属医院小儿外科，四川 南充 637000

ΔNp63是p63基因转录的产物之一，在结构上与p53具有高度的相似性，属于p53家族，主要表达于表皮、宫颈、泌尿系统等具有鳞状上皮分化潜能的基底细胞和旁基底细胞。最新的研究报道[1-2]，ΔNp63基因在上皮源性肿瘤中改变了肿瘤的侵袭、转移作用。ΔNp63在各不同组织学类型的子宫颈癌中高表达，且与肿瘤的分级相关[3]。这提示ΔNp63在宫颈癌发生、发展过程中起到重要的作用。为研究ΔNp63基因在宫颈癌中迁移、侵袭的机制，本研究针对人ΔNp63基因设计并合成小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）干扰此基因的表达，同时在体外进行观察ΔNp63基因对HeLa细胞迁移和侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

人宫颈癌细胞株HeLa细胞购于中国科学院上海细胞库；pGeneSil-1质粒购于武汉晶赛公司；lipofectamineTM2000购于Invitrogen公司；质粒提取试剂盒购于Omega公司。RPMI-1640购于武汉博士德生物工程有限公司；胎牛血清购于TBD公司。小鼠抗人ΔNp63多克隆抗体、小鼠抗人GAPDH单克隆抗体及兔抗小鼠IgG-HRP二抗均购于Santa Cruz公司。10×SDS-PAGE电泳缓冲液以及SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购于上海宝曼生物科技有限公司；PVDF膜购于Millipore 公司；其他试剂如：DEPC、MTT、G418、DMSO 等均购自Sigma公司。Transwell细胞培养小室购自Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 siRNA的设计、合成和标记 在GenBank查找人源ΔNp63基因序列，根据siRNA设计原则，并参考文献[4-5]，设计针对ΔNp63基因靶点的特异性寡核若酸序列，其序列为：AATGCCCAGACTCAATTTAGT；阴性对照siRNA是没有靶基因的无关对照小RNA。GFP标记的siRNA和阴性对照siRNA。以上序列均由武汉晶赛生物工程技术有限公司合成。

1.2.2 细胞培养、瞬时转染及细胞分组 HeLa细胞在37℃、5%CO2的细胞培养箱中用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养，规范换液传代。转染前利用胰酶消化收集细胞，将细胞按1×104个细胞/孔接种于6孔板。当细胞生长密度达到50%～70%时，采用lipofectamineTM2000脂质体转染干扰质粒，在转染24 h后通过倒置荧光显微镜观察HeLa细胞绿色荧光蛋白的表达情况。稳定转染后，将细胞分为4组：空白对照组（未转染的HeLa细胞），空载体组（只转脂质体的HeLa细胞），阴性质粒组（转染siRNA阴性对照的HeLa细胞），干扰质粒组（转染有阳性转染率的siRNA的HeLa细胞）。

1.2.3 Real-time PCR检测ΔNp63 mRNA的表达水平 转染后的HeLa细胞再培养48 h，利用胰酶消化收集细胞，按RNA提取试剂盒说明书中步骤提取各转染组HeLa细胞的总RNA，并逆转录为cDNA；应用Real-time PCR检测ΔNp63的mRNA表达水平。根据ΔNp63的cDNA序列设计引物，其上游引物为：5'-TGCGCAGACTCAATTTAGTGAG-3'，下游引物：5'-TCTGGATGGCGCATGTCTTTGC-3'。以 β-actin 作为内参，依据β-actin的cDNA序列设计引物，其上游引物为：5'-TGACGTGGACATCCGCTAAG-3'， 下游引物：5'-CTGGAAGGTGGACAGCCAGG-3'。以上引物皆由武汉晶赛生物工程 技术有限公司合成。 反应条件：94℃ 4 min；94℃ 20 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，循环35次，72℃检测信号。根据标准曲线计算ΔNp63的相对值。

1.2.4 Western blot检测ΔNp63的蛋白表达 转染后的HeLa细胞再培养48 h，利用胰酶消化收集细胞，用细胞裂解液提取细胞总蛋白，蛋白样本经变性后，10%SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜，在室温下5%脱脂奶粉封闭1 h，分别加1∶200小鼠抗人ΔNp63抗体和1∶3 000小鼠抗人GAPDH单克隆抗体，4℃孵育12 h。12 h后TBST漂洗，加1∶5 000兔抗小鼠IgG-HRP二抗，室温下孵育3 h，采用化学法曝光、显影。分析条带灰度值。

1.2.5 Transwell侵袭实验 采用强廷会等[6]的方法；预先用30 μg/mL 的 Matrigel胶 50 μL 处理 Transwell小室。 HeLa细胞转染培养48 h后，常规消化收集细胞。然后在侵袭小室的上部分别加入各组细胞100 μL（105），在侵袭小室的下部加入800 μL的10%FBS液，在37℃、5%CO2的细胞培养箱中孵化24 h。取出Transwell小室，去除小室上表面的细胞，4%多聚甲醛固定小室下表面的细胞20 min，用台盼蓝染色。光镜下记数穿过小室的HeLa细胞数，每组细胞各取5个视野计算其平均值。

1.2.6 同质黏附实验 将HeLa细胞接种于48孔培养板，培养至融合为单层细胞；弃培养液，37℃预热RPMI640，PBS冲洗去除悬浮细胞；RPMI640培养液重悬各组细胞至浓度为1×105个/mL，48孔板每孔加入 200 μL 重悬液，37℃培养 120 min，吸出培养液，用PBS洗细胞2次后计数未黏附细胞，每组重复4次；同质黏附细胞数=加入的细胞数-未黏附细胞数。

1.2.7 异质黏附实验 依照Barbieri CE的细胞黏附性实验方法，将转染培养48 h后的HeLa细胞1×105个/mL加入预先铺上Ⅳ胶原的96孔板中，在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养3 h后，PBS清洗并吸除未黏附的细胞，滴加浓度为5 mg/mL的 MTT 20 μL，室温下孵育 20 min，吸出 MTT 并滴入 200 μL的DMSO，用Bio-Rad酶联免疫检测仪测定其在590 nm处测吸光度A值，每组重复检测6次计算其平均值。

1.3 统计学方法

应用SPSS 17.0统计软件进行分析。计量资料数据以均数±标准差（）表示，多组间的比较采用方差分析，两两比较采用snk检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 siRNA-ΔNp63对HeLa细胞ΔNp63 mRNA表达的影响

采用RT-PCR法测定ΔNp63 mRNA表达水平，结果显示：在内参β-actin表达一致的条件下，阴性质粒组与空载体组细胞ΔNp63的mRNA表达水平与空白对照组比较,差异无统计学意义（P>0.05）；而干扰质粒组细胞中ΔNp63 mRNA的表达水平明显降低（P<0.05）。见表1。

表1 siRNA-ΔNp63对HeLa细胞ΔNp63 mRNA表达水平的影响（）

表1 siRNA-ΔNp63对HeLa细胞ΔNp63 mRNA表达水平的影响（）

注：Ct值为每个PCR反应管中荧光信号达到设定域值时经历的循环数；与其他组比较，aP<0.05，bP<0.05，cP<0.05

组别 β-actin平均Ct值 ΔNp63平均Ct值 ΔNp63相对值正常细胞组空载体组阴性质粒组干扰质粒组20.344±0.318 21.255±0.192 20.532±0.303 20.653±0.314 23.568±0.259 22.577±0.161 22.512±0.258 23.422±0.315 0.438±0.012a 0.411±0.008b 0.263±0.010c 0.155±0.006*

2.2 siRNA-ΔNp63对HeLa细胞的ΔNp63蛋白表达水平的影响

Western-blot分析显示，干扰质粒组细胞ΔNp63蛋白表达量（0.243±0.021）明显低于空白对照组（0.891±0.002）（P<0.05）， 而空载体组 （0.878±0.011） 和阴性质粒组 （0.746±0.003）与空白对照组细胞（0.891±0.002）比较，差异无统计学意义（P>0.05）。 见图 1。

图1 siRNA-ΔNp63对HeLa细胞的ΔNp63蛋白表达水平的影响

2.3 siRNA-ΔNp63干扰质粒对HeLa细胞侵袭能力的影响

四组细胞穿膜的细胞数分别为 （25.4±1.2）、（26.5±1.5）、（24.3±1.2）、（10.3±1.7）个。经统计学分析显示，空白对照组、空载体组和阴性质粒组三组之间的细胞穿膜数比较，差异无统计学意义（P>0.05）；而干扰质粒组穿过Matrigel基质胶滤膜的细胞数较其余三组明显减少（P<0.05）。见图2。

图2 Transwell侵袭实验结果

2.4 siRNA-ΔNp63干扰质粒对HeLa细胞同质黏附性的影响

阴性质粒组与空白对照组比较，二者同质黏附细胞数无明显差异，而siRNA-ΔNp63干扰质粒组分别与空白对照组和阴性质粒组比较，同质黏附细胞数明显增加。见表2。

表2 ΔNp63干扰质粒对HeLa细胞同质黏附的影响

2.5 siRNA-ΔNp63干扰质粒对HeLa细胞异质黏附性的影响

细胞异质黏附性实验提示，siRNA-ΔNp63组细胞的异质黏附性与空白对照组、空载体和阴性质粒组比较，差异有统计学意义（P<0.05），而空载体和阴性质粒组细胞的异质黏附性与空白对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见图3。

3 讨论

p63基因是Yang等[7]在1998年发现的与p53同源的基因，由于转录起始的不同而分为TAp63和ΔNp63两个亚型。ΔNp63在肿瘤中起癌基因作用[8-9]。近期研究表明，ΔNp63基因通过对侵袭、转移进行调节而影响肿瘤的发展[1,10-11]。

本研究采用脂质体法将siRNA-ΔNp63干扰质粒转染到HeLa细胞中。然后通过RT-PCR和Western-blot测定ΔNp63的表达，结果显示siRNA-ΔNp63干扰质粒明显降低HeLa细胞中ΔNp63的表达，这一结果表明siRNA-ΔNp63质粒成功抑制HeLa细胞中ΔNp63基因的表达。

侵袭和转移是恶性肿瘤特征性的生物学行为，也是致患者死亡的主要原因。肿瘤的侵袭和转移机制复杂，包括肿瘤细胞与细胞外基质黏附、降解基底膜和穿透基底膜是肿瘤细胞侵袭的三个重要环节[12]。因此，基底膜是阻止癌细胞侵袭、迁移的天然屏障。测定细胞穿透基底膜的能力可评估其侵袭能力。在本研究中，笔者通过MTT法检测在590 nm处的吸光度来反映肿瘤细胞的异质黏附性同时采用细胞计数法检测肿瘤细胞间的同质黏附性，结果提示siRNA-ΔNp63干扰质粒明显减弱HeLa细胞迁移能力。同时，通过Transwell侵袭实验来检测siRNA-ΔNp63干扰质粒对HeLa细胞侵袭能力的改变，结果显示，稳定表达siRNA-ΔNp63干扰质粒的HeLa细胞在体外与阴性质粒组和空载体组比较，穿透侵袭能力明显减弱。

图3 细胞黏附实验各组细胞的平均吸光度值

通过本课题组的研究，ΔNp63基因表达的降低明显减弱了HeLa细胞的侵袭能力，其作用机制目前尚不明确，有待于进一步研究。本研究为ΔNp63基因在宫颈癌侵袭转移中的作用提供了一定的实验基础。

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