救必应对小鼠急性化学性肝损伤的保护作用

陈 壮 肖 刚

1.广西中医学院附属瑞康医院，广西 南宁 530011；2.右江民族医学院，广西 百色 533000

救必应为冬青科冬青属植物铁冬青（Ilex rotunda Thunb.）的干燥树皮，又名龙胆仔、冬青仔、碎骨木、过山风、白皮冬青、大叶冬青等，味苦性寒，有清热解毒、凉血止血、行气止痛等功效，始载于《岭南采药录》，为我国南方地区民间常用草药[1]。两广民间多用于清热解毒，止血抗菌[2]，常用于治疗感冒发热、扁桃体炎、咽喉肿痛、急慢性肝炎、急性肠胃炎、胃及十二指肠溃疡、风湿性关节痛、跌打损伤、烫火伤等[3]。其治疗跌打损伤、烫火伤效果显著，美其名为救必应[4]。目前对其药理作用的研究主要集中于心血管系统，但对于其保肝降酶作用的研究还没见报道。本实验主要研究救必应的水提物（IRTW）对CCl4诱导小鼠急性化学性肝损伤的保护作用及其机制；观察救必应水提物的保肝降酶作用，为其临床应用提供理论依据并为进一步提取分离确切的药效部位奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 受试药品：IRTW，本单位自制；阳性对照药：联苯双酯（BPD）（北京协和药厂生产，批号：08110103）；试剂：四氯化碳（CCl4）（分析纯）（上海长江化工厂生产，批号：20040512）；谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷光甘肽（GSH-Px）测定试剂盒，均来自南京建成生物工程研究所 （批号分别为20110415、20110516、20111018、20110820、20110810）。

1.1.2 仪器 电子分析天平 （德国赛多利斯生产，型号：BSA124S）；DY289型电动玻璃匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；台式高速离心机[上海医疗器械（集团）有限公司手术器械厂]；高速低温离心机（德国Biofuge Stoucctos）；微量加样器Gilson（法国）；液体快速混合器（江西医疗器械厂，型号：YKH-I）；切片机（德国美康HM355S型全自动切片机）；摄影仪：OlympusPM-10型显微摄影仪；恩普半自动生化分析仪EMP-168G（深圳市恩普电子技术有限公司生产）；Agilent8453紫外可见分光光度计（美国）。

1.1.3 动物 SPF级昆明种小白鼠，18～22 g，雌雄兼用，由广西医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（桂）2009-0002。 小鼠分性别饲养于空调室内，室温（22±2）℃，湿度（70±5）%，喂标准颗粒饲料，自由饮水和摄食。

1.2 方法

取60只小鼠，雌雄各半，按体重随机平均分为6组（每组各10只），即正常对照组（空白对照组），CCl4模型组，联苯双酯组（BPD）（150 mg/kg），IRTW 高、中、低剂量组（相当于原料药 200、100、50 mg/kg），均灌胃给药，剂量为 20 mL/kg，正常对照组和CCl4模型组灌胃给纯净水，每天1次，共12 d。第12天除正常对照组注射等体积的花生油外，其余各组腹腔注射含有0.08%CCl4的花生油，剂量为0.1 mL/10 g，并禁食16 h后，自取小鼠后眼眶静脉丛取血，取肝脏作下列相关指标检测：①收集血液，室温静置1 h后，于3 000 r/min离心15 min，分离血清检测ALT、AST水平。②取肝右叶制备10%肝匀浆，分别采用相关试剂盒测定SOD、MDA、GSH-Px。③取肝左叶经10%福尔马林溶液固定，包埋，切片，采用HE染色方法进行肝组织病理检查。

1.3 统计学方法

采用SPSS 12.0软件包进行数据处理，计量资料数据以均数±标准差（）表示，比较采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IRTW对CCl4小鼠急性肝损伤血清ALT、AST的影响

CCl4模型组血清ALT、AST水平显著升高 （P<0.01），IRTW能不同程度地降低肝损伤小鼠血清ALT和AST水平（P<0.01或P<0.05）。提示IRTW对CCl4急性肝损伤小鼠肝脏有一定的保护作用。见表1。

表1 IRTW对CCl4急性肝损伤小鼠血清中ALT、AST的影响（n=10，）

表1 IRTW对CCl4急性肝损伤小鼠血清中ALT、AST的影响（n=10，）

注：与正常对照组比较，▲P<0.01；与 CCl4模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；“-”为无数据

组别 剂量（mg/kg） ALT（U/L） AST（U/L）正常对照组CCl4模型组BPD组IRTW高剂量组IRTW中剂量组IRTW低剂量组--150 200 100 50 37.24±15.63 183.57±38.34▲78.43±19.07**111.65±21.97**115.84±22.38**151.64±27.58*40.35±13.27 172.91±44.86▲80.77±18.92**112.84±23.91**117.76±19.37**148.63±31.43*

2.2 IRTW对CCl4小鼠急性肝损伤肝组织匀浆中SOD、MDA、GSH-Px的影响

与正常对照组比较，CCl4模型组肝组织中MDA含量明显升高，SOD与GSH-Px活性显著降低（P<0.01），提示肝脏出现脂质过氧化。而IRTW能不同程度地抑制肝组织中MDA的升高（P<0.01或P<0.05），并使SOD和GSH-Px活性明显升高（P<0.01或P<0.05），说明IRTW有很好的抗氧化及清除氧自由基的作用。见表2。

2.3 小鼠肝脏病理组织学检查结果

小鼠肝组织病理形态学观察结果显示，正常对照组小鼠肝脏外观呈红褐色，质地湿润，柔软有光泽且富于弹性，肝小叶结构正常，轮廓清晰，肝细胞排列整齐，大小均匀，分界清楚，无肿胀，无明显水肿、脂肪变性，无坏死，无炎症细胞浸润（图1）；CCl4模型组小鼠肝脏体积增大，呈弥漫性气球样变，质脆边缘钝而厚，表面黄褐色，结构紊乱不清，肝细胞核消失，出现以中央静脉为中心的局部病灶性肝细胞变性、坏死和大量炎症细胞浸润（图2）；BPD组小鼠肝脏颜色较红润，有部分肝细胞有胞浆疏松，轻度细胞水肿，偶见气球样变，少量炎症细胞浸润（图3）；IRTW高、中剂量组小鼠肝脏颜色较红润，无明显坏死，稍有轻度水肿，大部分肝细胞结构正常（图4、5），IRTW低剂量组虽未完全表现为正常对照组的红褐色，但较CCl4模型组有明显改观，肝细胞仍见肿胀，大片肝细胞轻度至中度细胞水肿，偶见气球样变，灶性坏死及炎症细胞浸润（图6）。提示IRTW对急性化学性肝损伤有保护作用。

表2 IRTW对CCl4急性肝损伤小鼠肝组织匀浆中SOD、MDA、GSH-PX 的影响（n=10，）

表2 IRTW对CCl4急性肝损伤小鼠肝组织匀浆中SOD、MDA、GSH-PX 的影响（n=10，）

注：与正常对照组比较，▲P<0.01；与 CCl4模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；“-”为无数据

组别 剂量（mg/kg）MDA（nmol/mL）SOD（U/mgprot）GSH-PX（U/mgprot）正常对照组CCl4模型组BPD组IRTW高剂量组IRTW中剂量组IRTW低剂量组--150 200 100 50 6.42±1.27 18.76±2.05▲9.55±1.86**11.17±2.29**12.36±2.85**14.26±3.14*235.32±41.27 129.86±35.49▲194.16±42.09**168.91±38.75**157.34±32.71**135.46±34.55*164.41±39.77 73.62±29.35▲107.52±37.28**86.67±32.65**88.83±29.57**81.73±33.24*

3 讨论

CCl4肝损伤动物模型是研究化学性肝损伤的经典模型[5-6]，CCl4诱导肝损伤主要是通过细胞色素P450将CCl4分解为CCl3自由基团，能选择性地损伤小叶中央区的肝细胞，引起脂质过氧化反应，破坏细胞膜结构，使肝细胞变性坏死，细胞内ALT、AST、自由基渗入血液而活性增高[7]。MDA是一种脂质过氧化反应的次产物[8]，可进一步与磷脂酰乙醇胺和蛋白质交联，生成无活性脂褐质，沉积于组织细胞中，破坏细胞膜结构，最后导致细胞无法维持正常代谢而死亡。SOD是机体内清除自由基的重要抗氧化酶之一，CCl4的摄入使其活性减弱，引起不饱和脂肪酸氧化生成过氧化物，形成脂褐质以及使DNA、蛋白质和酶等改变、破坏，从而加速肝脏损伤。而GSH-Px是机体内广泛存在的一种含硒抗氧化酶[9]，可通过特异性催化GSH对氢化氧化物的还原反应，而消除细胞内有害的过氧化代谢产物，以阻断脂质过氧化连锁反应，从而对保护细胞代谢的正常进行起到重要作用。

本实验结果显示：IRTW三个剂量组能不同程度地降低CCl4可引起肝损伤小鼠血清中ALT、AST及肝匀浆MDA水平，能不同程度地增高肝损伤小鼠肝匀浆SOD和GSH-Px的水平，且对小鼠肝脏的病理学损伤也有明显改善。实验研究表明IRTW对急性化学性肝损伤具有显著保护作用，其作用机制可能是通过提高SOD、GSH-Px等抗氧化物酶的活性，从而清除氧自由基，防止脂质过氧化，稳定细胞膜，而起到保护肝细胞的作用。

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[4]国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].上海：上海科学技术出版社，1998：163-164.

[5]徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学[M].3版.北京：人民卫生出版社，2005：1346.

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