DIDS对SIN-1诱导大鼠海马神经元凋亡及PARP-1/AIF表达的影响

李 曦，尹金宝，钟志超，范洪领，许黎娟，郑原印，蔡仕宁，常全忠

(1.遵义医学院珠海校区生理学教研室，广东珠海 519041;2.广东医学院东莞校区病理学教研室，广东 东莞 523770)

资料显示，氯通道可能在多种非神经细胞凋亡过程中起重要的作用［1－2］。Takahashi等［3］在转基因小鼠中利用STS诱导培养心肌细胞凋亡，结果显示氯通道阻断剂DIDS和NPPB能够抑制缺血心肌细胞的凋亡，认为ClC-3氯通道可能参与缺血心肌细胞的凋亡。

目前对氯通道是否参与缺血性脑损伤后海马神经元的凋亡过程报道甚少。本研究模拟脑缺血性脑损伤一氧化氮(NO)过量产生的机制，利用SIN-1作为NO供体诱导离体大鼠海马神经元凋亡，试图通过观察氯通道的活动是否参与了神经元的凋亡过程，探讨缺血缺氧敏感性神经元的凋亡与氯通道之间的关系，为临床脑缺血神经元损伤产生机制的研究和治疗提供新的实验参考。

1 材料与方法

1.1 动物和试剂 新生1 d SD大鼠由遵义医学院珠海校区动物实验中心提供;Neurobasal培养基、B27购自Gibco BRL公司，多聚赖氨酸(poly-D-Lysine，PLL)、阿糖胞苷、DIDS(4，4'-diisothiocyanatostilbene-2，2'disulfonic acid)、MTT(Thiazolyl Blue Tetrazolium)SIN-1(3-morpholinosyndnomine)、Poly(ADP-ribose)polymerase-1(PARP-1)、Apoptosis-inducing factor(AIF)和Hoechst 33258等试剂购自美国Sigma公司;胎牛血清(杭州四季青公司);二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(香港试剂公司);Anti-Caspases-3(Santa Cruz)。

1.2 海马神经元的培养 参照方法［4］取生1 d内的SD大鼠，♀♂不拘，无菌断头取脑，在冰冷DHank's里分离双侧海马，剪成约1 mm3小块，用0.25%浓度的胰蛋白酶37℃ 消化15 min，加基础培养基终止消化，机械吹打分散细胞，400目筛网过滤，制成单细胞悬液，1 000 r·min－1室温离心10 min，去上清液，加完全培养基，吹打分散细胞后制成4×108个·L－1的单细胞悬液，接种在预先包被有PLL的24孔或96孔培养扳内，置于培养箱内，通以95%空气、5%CO2，37℃饱和湿度下培养。培养液中含有90%Neurobasal培养基、10%胎牛血清，2×10－3mol·L－1谷氨酰胺、1 ×105IU·L－1青、链霉素。接种48 h后更换培养液，同时加入1×10－5mol·L－1阿糖胞苷作用48 h，常规更换培养液。

1.3 实验分组 取培养12 d的海马神经元，随机分为:正常对照组(仅用Neurobasal完全培养基);SIN-1处理组;SIN-1+氯通道阻断剂DIDS组。参照实验［5］SIN-1 的作用浓度是 0.5 mmol·L－1，与氯通道阻断剂的作用时间均为18 h。氯通道阻断剂与SIN-1同时加入培养基内。

1.4 MTT法细胞存活率的测定 参照方法［5］，取96孔培养板培养12 d的海马神经元，加入MTT，终浓度为0.5 g·L－1，37℃下继续培养4 h后吸去培养液，加入DMSO振荡10 min，以不加细胞的培养液空白孔作对照，酶标仪(Bio-tek，USA)检测光密度OD。

1.5 Hoechst 33258 DNA荧光染色 参照方法［6－7］，将海马神经元用 0.01 mol·L－1pH 7.4 的PBS冲洗1次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗3次，山羊血清封闭，加 Hoechst 33258(Sigma，St.Louis，MO，USA)(0.25 m/g·L－1)，静置 15 min，倒置荧光显微镜(Olympus，Tokyo，Japan)200倍视野观察细胞核的形态，摄像，随机计数3个视野内200个细胞，计算凋亡细胞百分数。

1.6 免疫组织化学荧光对PARP-1和AIF染色参照方法［8－9］对神经元进行PARP-1和AIF的免疫荧光染色:将海马神经元用0.01 mol·L－1pH 7.4的PBS冲洗1次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗3次，山羊血清封闭，加入一抗抗PARP1(兔抗鼠，Sigma，St.Louis，MO，USA)(1∶800)或抗AIF(兔抗鼠，Sigma，St.Louis，MO，USA)(1 ∶800)，4℃过夜，加荧光标记的二抗IgG(羊抗兔，1∶200，武汉，博士德)，30 min后荧光显微镜(Olympus，Tokyo，Japan)下观察，摄像。

1.7 Western blot测定 Caspase-3、PARP-1和AIF蛋白 取各组海马神经元，参照方法［10－11］处理细胞提取细胞蛋白，用冰冷的0.1mol·L－1PBS洗涤2次→加85℃的上样缓冲液收集细胞→SDS-PAGE电泳→PVDF膜转移→3%BSA封闭液封闭，4℃过夜→加兔抗鼠多克隆抗体Caspase-3(1∶5 000)或抗鼠PARP-1(1∶5 000)或抗鼠AIF抗体(1∶5 000)，室温反应2 h→TBS-Trs溶液洗3×10 min→HRP-标记的羊抗兔IgG(1∶2 000)室温反应2h→TBS-T洗3次×5min→ECL显影→压片曝光。

2 结果

2.1 DIDS拮抗NO作用的浓度效应 0.5 mmol·L－1SIN-1组的细胞生存率为61.28%，氯通道阻断剂DIDS对NO供体SIN-1诱导海马神经元损伤具有拮抗作用并有浓度依赖性，0.1 mmol·L－1的DIDS对神经元损伤的保护效应比较明显，与SIN-1组相比差异有显著性。结果如Fig 1。

Fig 1 Effects of DIDS on the cultured hippocampal neuronal injury induced by SIN-1(±s，n=6)

2.2 Hoechst 33258染色结果 正常对照组神经元的核呈蓝色荧光，SIN-1(0.5 mmol·L－1)组大量神经元的核呈强亮色荧光并较正常核小，提示核固缩，神经元凋亡;SIN-1(0.1 mmol·L－1)+DIDS(0.1 mmol·L－1)组的强亮色荧光明显减少。如Fig 2。

Fig 2 Effects of DIDS on the cultured hippocampal neuronal apoptosis induced by SIN-1.

2.3 免疫组织化学荧光染色结果 免疫荧光染色显示，抗NeuN抗体呈红色，抗PARP-1/AIF抗体呈绿色，SIN-1组有明显的PARP-1/AIF荧光增强，SIN-1+DIDS组的荧光较SIN-1组减弱(Fig 3)。

Fig 3 Immunofluorescent results

2.4 Western blot对各组 Caspase-3、PARP-1/AIF蛋白检测结果 Western blot结果显示:正常培养的神经元内的Caspase-3很少被激活，蛋白印迹可表现出32 ku肽段条带，SIN-1处理后的神经元内有大量的Caspase-3活化的片段17KD和11 ku，氯通道阻断剂DIDS(0.1 mmol·L－1)能不同程度的减少Caspase-3的激活;PARP-1的活化形式89 ku和AIF(67 ku)在SIN-1+DIDS组明显弱于SIN-1组(Fig 4)。

Fig 4 Results of Western blot.

3 讨论

在缺血性脑损伤中，海马是最容易损伤的部位，而且缺血后的半暗区神经元的主要损伤方式是凋亡，过量产生的NO是神经元凋亡机制之一［12］。本实验模拟缺血性脑损伤的发生机制，用SIN-1作为NO供体诱导离体大鼠海马神经元凋亡。SIN-1在水溶液中能释放出大量NO并形成OONO－自由基产生细胞毒性作用［7］。本研究通过分析细胞生存率和凋亡执行蛋白Caspase-3的变化，与对照组相比差异有显著性，提示SIN-1(0.5 mmol·L－1)诱导的神经元凋亡模型是成功的。

正常情况下，Caspase-3是32 ku没有活性的形式存在，凋亡发生时，没有活性的Caspase-3断裂为有活性的17 ku和11 ku片段，Caspases-3的激活是细胞遭受各种损伤后Caspase依赖性凋亡信号通路的执行蛋白酶，Caspase-3的抑制可以保护细胞免受凋亡的损伤，检测该酶的活性状态可以作为检测细胞发生凋亡的指标，理论上抑制该酶的活性是抑制凋亡发生的有效措施［9］。本实验结果显示，DIDS(0.1 mmol·L－1)明显抑制了Caspase-3的激活，提示氯通道阻断剂可通过Caspase依赖性途径抑制神经元凋亡。目前认为，PARP-1/AIF是神经元非Caspase依赖性凋亡信号通路中的靶点分子，PARP-1在正常情况下参与DNA的修复，过量表达并激活产生的片段可引起神经元的凋亡［13－14］。本研究通过免疫荧光和蛋白电泳检测显示，DIDS能明显削弱PARP-1/AIF的表达并能减少PARP-1的活性形式89 ku的形成，提示DIDS的抗凋亡作用可能与此途径有关。

本实验结果提示，氯通道的活动可能参与了NO供体SIN-1诱导神经元凋亡过程，在这一过程中，氯通道的活动通过什么机制抑制了凋亡通路中信号蛋白的表达有待于进一步研究。揭示氯通道在神经元凋亡中的作用，将为凋亡的发生机制从离子通道方面提供新的理论，为临床脑缺血性脑损伤的治疗和靶点药物的探索提供实验和理论参考。

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