HIV gp41融合多肽对抗原特异性Treg活化的抑制作用

胡义平，贺龙刚，李润明，李珉珉，张嘉杰，刘叔文，李晓娟

(1.南方医科大学药学院，广东广州 510515;2.暨南大学附属第一医院，广东广州 510630)

HIV感染引起的艾滋病，在中国乃至全世界都属于重大疾病，却无有效的预防性疫苗。由于HIV主要感染CD4+T淋巴细胞，病毒与免疫细胞的相互作用是疾病研究的关键［1］。在CD4+T细胞，具有免疫抑制作用的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)与 HIV 感染密切相关［2－3］:Treg 比 CD4+记忆性T细胞更易感染HIV;感染早期，病毒抗原刺激产生的特异性Treg，聚集在人体内HIV复制的主要部位淋巴结;Treg数目在早期和进展病人中升高，随后不断减少，到艾滋病后期大量耗竭［4］。

HIV gp41融合多肽(fusion peptide，FP)可以插入CD4+T细胞膜，启动病毒与靶细胞膜的融合，实现病毒的感染［5］。此外，FP还能通过插入人和小鼠细胞膜，与TCR结合，影响抗原递呈细胞(antigen presenting cells，APC)递呈的活化信号与TCR交联，抑制抗原特异性CD4+T细胞的活化［6］。Treg活化也需要 TCR 的信号［7－8］，然而 FP 能否因此影响抗原特异性的Treg细胞活化未见报道。

本研究中，我们分离DO11.10 OVA转基因小鼠CD4+CD25+Treg，用OVA刺激抗原特异性Treg细胞活化［9］，观察FP多肽对Treg细胞活化后免疫抑制功能、相关细胞因子IL-10表达的影响;由于FP也可以插入小鼠的细胞膜［6］，我们检测Treg细胞表面FP与TCR的共分布情况，初步探讨FP对抗原特异性Treg活化的影响。本研究将有助于深入理解HIV病毒与机体的相互作用。

1 材料与方法

1.1 材料 DO11.10转基因小鼠(♀，6～12周龄)，购自南京大学遗传动物所，清洁级BALB/c近交系小鼠(♀性，6～8周龄)购自南方医科大学实验动物中心。RPMI 1640培养基，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和β-二巯基乙醇购自美国Gibco公司产品。CCK-8(Cell Counting Kit-8)试剂盒购自日本Dojindo化学研究所，二抗AlexFluo 488 goatanti-mouse IgG2a购自美国 Invitrogen公司。Anti-Mouse DO11.10 TCR FITC(Clone:KJ1-26)、小鼠IL-10的ELISA检测试剂盒，CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞检测试剂盒购自美国eBioscience公司。CD4+CD25+调节性T细胞MACS磁珠分离试剂盒购自德国美天旎公司。FP1-25(AVGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQL)、FP-Rho、FP 对照多肽(VLGGGCALLRCIPALDSLTPANED，FP Scram)由以色列魏兹曼研究所 Yechiel Shai实验室提供。OVA323-339由上海强耀公司合成。

1.2 方法

1.2.1 CD4+CD25+调节性 T 细胞和 CD4+CD25－效应性T细胞的分离和检测 分离小鼠脾脏细胞，按MACS磁珠分离试剂盒说明书获得纯化的CD4+CD25－效应性T细胞(Teff)和CD4+CD25+Treg细胞;分离前后 CD4+CD25－、CD4+CD25+T细胞纯度用流式细胞仪检测，分离前Treg细胞Foxp3检测按试剂盒说明进行［10］。

1.2.2 CCK-8 法分析 CD4+CD25－效应性 T 细胞增殖 CD4+CD25－效应性T细胞按5×104/孔加入96孔板里，加或不加CD4+CD25+调节性 T细胞(2.5×104/孔)，再加入3×105/孔丝裂霉素 C(mitomycin C)处 理 的 小 鼠 脾 细 胞 作 为 APC［11］。OVA323-339 终浓度为 100 μg·L－1，FP 和对照多肽为25 mg·L－1。培养3 d后，结束前4 h每孔加入20 μl CCK-8，每组设3个复孔，检测OD450反映CD4+CD25－T细胞增殖。由于Treg细胞具有免疫无能性，受抗原等刺激后不增殖，而经过丝裂霉素C处理后的小鼠脾细胞也失去增殖活性，在丝裂原等刺激下不增殖，只保留其递呈抗原的功能。因此，我们通过CCK-8法检测的主要是CD4+CD25－Teff细胞的增殖，同时反映出Treg体外抑制Teff增殖的功能。

1.2.3 ELISA分析 Treg细胞 IL-10的分泌 5×104个DO11.10小鼠 CD4+CD25+Treg细胞与3×105个 APC(同上)加入96孔板中，加 OVA323-339和FP多肽共培养，3 d后收集上清，ELISA检测上清IL-10分泌。

1.2.4 荧光共聚焦检测Treg细胞表面FP和TCR的分布 磁珠分离DO11.10 OVA Tg小鼠脾脏Treg，按5×104/孔加入96孔板，加入 3×105/孔丝裂霉素C处理的BALB/C小鼠脾脏细胞作为APC，加 OVA323-339 100μg·L－1刺激 3 d。收集细胞后用4%多聚甲醛固定，加抗DO11.10小鼠OVA TCR抗体和抗TCR抗体的二抗孵育，孵育的最后5 min加入FP-RHO。细胞用PBS离心冲洗后加到玻璃片上，荧光共聚焦检测细胞膜表面TCR和FP的分布情况。

2 结果

2.1 CD4+CD25+调节性T细胞和CD4+CD25-效应性T细胞的分离后纯度检测［11］磁珠分选前后进行细胞的流式细胞仪检测:Fig 1A为分选前的小鼠脾细胞CD4+CD25+调节性T细胞和CD4+CD25－效应性T细胞比例;以 CD4+CD25+双阳性圈出设门，分析Foxp3的表达(Fig 1B)，表明CD4+CD25+T细胞确为高表达Foxp3的天然调节性T细胞。细胞经分选后，CD4+CD25－效应性T细胞和CD4+CD25+调节性T细胞纯度均可达90%以上(Fig 1C、D)，进行后续实验。

2.2 FP对Treg细胞抑制功能的影响 结果表明，FP多肽本身对Teff细胞增殖具有抑制作用。Treg:Teff(1∶2)共培养时，Treg能够明显抑制Teff细胞的增殖，抑制率约为35.2%;而在FP 25 mg·L－1存在的情况下，Treg对Teff增殖的抑制降低，抑制率约为27.0%(Fig 1)。FP对照多肽无影响。

Fig 1 Foxp3 expression of CD4+CD25+regulatory T cells and purity test of Teff and Treg

*P＜0.05 vs OVA stimulated Teff group;#P＜0.05 vs OVA+FP25 treated stimulated Teff+Teff group

2.3 FP对OVA激活的Treg细胞IL-10表达的影响 在Treg与APC共培养的情况下，10 μg·L－1和100 μg·L－1OVA能剂量依赖性刺激Treg分泌IL-10。FP 在25 mg·L－1的浓度时能明显抑制 100 μg·L－1OVA刺激的IL-10表达。FP对照多肽无作用(Fig 3)。

Fig 3 Effects of FP on IL-10 production in OVA activated Treg

2.4 FP在活化的Treg细胞表面能与TCR重叠OVA刺激后，在活化的OVA Tg小鼠分离的Treg细胞表面，TCR荧光呈半月形，FP和TCR分布一致，出现荧光的重叠，而在非活化细胞绿色荧光呈圆环型，表面未见红色荧光(Fig 4)。由于已知FP和TCR跨膜区能够互相结合［6］，结果提示FP与TCR信号的重叠可能产生相互作用，从而影响APC向Treg递呈信号、干扰Treg活化。

3 讨论

HIV gp41融合多肽是启动病毒感染的重要多肽。HIV包膜蛋白gp120与靶细胞上CD4受体和辅助受体结合后，跨膜亚基gp41暴露出来，位于其N末端的FP可以插入靶细胞膜，启动N-端和C-端螺旋重复序列形成六聚体，拉近病毒和靶细胞膜的距离发生融合，从而使病毒基因组进入并感染宿主细胞［5］。

HIV主要感染CD4+的T淋巴细胞，它与宿主免疫细胞的相互作用是影响疾病发展的重要因素，也是影响疫苗成功的基础因素。近年有报道，FP能抑制抗原特异性的CD4+T细胞活化，并缓解抗原诱导的关节炎。FP对T细胞活化的作用是TCR依赖性的:它可以插入人和小鼠CD4+T细胞膜，与TCR的跨膜区结合，可能通过影响TCR、CD3分子的对话(cross-talk)发挥抑制作用。FP不影响抗原呈递细胞的功能，对非抗原特异性的包被抗CD3抗体或PMA/inomycin刺激的T细胞活化(两个系统均不依赖APC)无影响。因此，FP在插入靶细胞膜的时候，可能同时抑制了CD4+T细胞对HIV病毒抗原特异性的免疫应答［6］。占CD4+T细胞5% ～10%的调节性T细胞(CD4+CD25+Foxp3+，Treg)与HIV的感染和进展关系密切［12］，Treg活化也离不开TCR［7－8］，但是未知 FP 能否因此抑制抗原特异性的Treg活化。

Fig 4 Colocalization of FP and TCR on activated Treg cells

我们研究发现FP在体外能减低抗原活化后Treg细胞的免疫抑制功能和IL-10分泌。由于Treg激活后可以通过细胞间直接接触或通过分泌IL-10、TGF-β等细胞因子对局部免疫产生抑制作用，提示FP减低Treg的抑制功能可能与降低IL-10的分泌有关［14］。另外，荧光共聚焦结果显示FP能插入OVA活化的Treg细胞表面，与TCR分布一致。由于TCR介导Treg的活化［15］，Treg的激活通常也需要经过TCR和辅助信号刺激［7－8］，提示 FP也可能通过与TCR结合影响APC递呈信号给TCR，从而抑制抗原刺激的Treg细胞活化和功能。

在HIV感染时，FP能插入Treg细胞膜，导致可能因此影响Treg功能和免疫应答，尤其是在Treg增多的情况下。由于在HIV感染的早期，淋巴结中存在病毒抗原特异性的Treg细胞活化;在不能良好控制病毒复制的HIV阳性感染者(Non-controllers)的肠道中存在升高的Treg细胞［13］，FP对Treg的影响可能影响病毒感染的进程。Treg对HIV感染的影响可概括为好和坏两方面［3］:好的一面是Treg及其功能蛋白Foxp3能够抑制HIV病毒复制(HIV主要感染活化的细胞，并在活化的细胞内复制，而Treg抑制CD4效应T细胞活化)，有助于控制慢性免疫激活和激活造成的T细胞死亡、免疫系统崩溃;坏的一面是Treg可抑制机体对HIV的免疫应答和清除，易于造成病毒的持续感染。

综上，HIV融合多肽能插入活化的Treg细胞表面，减弱抗原特异性的小鼠Treg细胞活化;FP对抗原特异性Treg细胞的影响，可能改变病毒和机体免疫细胞之间感染和抗感染力量的对比，影响艾滋病的疾病进展和疫苗免疫。

［1］ Stevenson M.HIV-1 pathogenesis［J］.Nat Med，2003，9(7):853－60.

［2］ 苑 航，夏大静，曹雪涛.CD4+CD25+调节性T细胞与HIV感染关系研究进展［J］.国际流行病学杂志，2006，33(2):83 －5.

［2］ Yuan H，Xia D J，Cao X T.CD4+CD25+regulatory T cells in HIV infection［J］.Int J Epid Infect Dis，2006，33(2):83 －5.

［3］ Rouse B T，Sarangi P P，Suvas S.Regulatory T cells in virus infections［J］.Immunol Rev，2006，212:272 －86.

［4］ Nilsson J，Boasso A，Velilla P A，et al.HIV-1-driven regulatory T-cell accumulation in lymphoid tissuses is associated with disease progression in HIV/AIDS［J］.Blood，2006，108(12):3808 －17.

［5］ Liu S，Jing W，Cheung B，et al.HIV gp41 C-terminal heptad repeat contains multifunctional domains.Relation to mechanisms of action of anti-HIV peptides［J］.J Biol Chem，2007，282(13):9612－20.

［6］ Quintana F J，Gerber D，Cohen I R，et al.HIV-1 fusion peptide targets the TCR and inhibits antigen-specific T-cell activation［J］.J Clin Invest，2005，115:2149 － 51.

［7］ Fontenot J D，Rudensky A Y.A well adapted regulatory contrivance:regulatory T cell development and the forkhead family transcription factor Foxp3［J］.Nat Immunol，2005，6(4):331 －7.

［8］ Sakaguchi S.Naturally arising Foxp3-expressing CD25+CD4+regulatory T cells in immunological tolerance to self and nonself［J］.Nat Immunol，2005，6(4):345 －52.

［9］ Takahashi T，Kuniyasu Y，Toda M，et al.Immunologic self-tolerance maintained by CD25+CD4+naturally anergic and suppressive T cells:induction of autoimmune disease by breaking their anergic/suppressive state［J］.Int Immunol，1998，10(12):1969 －80.

［10］李晓娟，胡义平，刘 燕，等.TF3-H4对CD4+CD25+调节性T细胞和CD4+CD25－效应性T细胞早期活化的影响［J］.中国药理学通报，2012，28(3)，421 －4.

［10］ Li X J，Hu Y P，Liu Y，et al.Effects of TF-3-H4 on the early activation of CD4+CD25+Treg cells and CD4+CD25－Teff cells in mice by flow cytometry［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28(3)，421－4.

［11］ Li X，Hu Y，He L，et al.Icaritin inhibits T cell activation and prolongs skin allograft survival in mice［J］.Int Immunopharmcol，2012，13(1):1－7.

［12］ Suchard M S，Mayne E，Green V A，et al.FOXP3 expression is upregulated in CD4 T cells in progressive HIV-1 infection and is a marker of disease severity［J］.PLoS One，2010，5(7):e11762.

［13］ Shaw J M，Hunt P W，Critchfield J W，et al.Increased frequency of regulatory T cells accompanies increased immune activation in rectal mucosae of HIV-positive noncontrollers［J］.J Virol，2011，85(21):11422－34.

［14］ Torheim E A，Ndhlovu L C，Pettersen F O，et al.Interleukin-10-secreting T cells define a suppressive subset within the HIV-1-specific T-cell population［J］.Eur J Immunol，2009，39(5):1280 －7.

［15］ Moran A E，Holzapfel K L，Xing Y，et al.T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse［J］.J Exp Med，2011，208(6):1279－89.