葛根散等3首解酒方对急性酒精中毒小鼠Caspase3/8活性的影响

田维毅， 王文佳， 韩 洁， 王庆学， 杨 柱

(贵阳中医学院，贵州贵阳550002)

酒精引起的健康损害已成为当代社会的一个严重公共卫生问题。肝脏是酒精损害的最主要脏器，近年来发现，肝细胞凋亡在酒精性肝病的发生和发展过程中具有重要作用，已成为该领域的研究热点之一。Caspases(Cysteinyl asparate specific proteinase)是一种特异性蛋白酶，因其介导细胞凋亡而备受关注［1］。在哺乳动物细胞，Caspase以依赖线粒体和非依赖线粒体两条途径促进细胞凋亡，其中Caspase8和Caspase3发挥着重要作用。Caspase8是细胞凋亡的启动者，被激活后可引起下游Caspase“瀑布式”激活，且可将凋亡信号从非依赖线粒体途径传递到线粒体途径，把死亡受体通路和线粒体通路联系起来，放大凋亡信号;Caspase3是线粒体-细胞色素 C途径、死亡配体和(或)受体途径、颗粒酶B途径的共同通路，在凋亡过程中处于核心位置，是细胞凋亡的关键蛋白酶和主要效应因子［2］。在前期研究中，我们初步筛选出葛根散 (金·张子和《儒门事亲》)、石膏汤 (解酒验方)、葛花解酲汤 (元·李东桓《脾胃论》)等3个经方/验方能有效解酒防醉、保护酒精导致的肝功能损伤、缓解肝组织病理损害、减少肝细胞凋亡［3-5］。为了深入探索上述解酒方减少肝细胞凋亡的部分机制，本实验通过复制急性酒精中毒小鼠模型，考察上述解酒方对实验动物Caspase3/8活性的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级昆明种小鼠，雄性，体质量18～22 g，购自贵阳医学院实验动物中心［许可证号:SCXK(黔)20020001］。

1.2 主要仪器与试剂 AB135-S型梅特勒托利多电子天平(梅特勒托利多上海公司);ELx800全自动酶标仪 (美国biotek);56%(V/V)红星二锅头白酒为北京红星股份有限公司产品 (批号001215);ALT、AST检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所;Caspase3及Caspase8活性检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 实验药材 实验用方剂包括葛根散 (金·张子和《儒门事亲》)、石膏汤 (解酒验方:石膏12 g、葛根10 g、干姜6 g)、葛花解酲汤 (元·李东桓《脾胃论》)，组方药材购自贵阳同仁堂大药房，经鉴定为正品，按原方比例常规制备水煎剂 (生药浓度为1 g/mL)备用。

1.4 动物分组与处理 将小鼠随机分为正常对照组、模型对照组、各方大/中/小剂量给药组，每组15只。根据药理实验动物给药折算方法，以成人常规用量折算实验小鼠用药量，各给药组以不同浓度的中药水煎剂0.2 mL/(次·只)灌胃。各方实验给药剂量分别为:葛根散0.2 g/0.1 g/0.05 g(生药)/10 g(小鼠体质量);石膏汤0.1 g/0.05 g/0.025 g(生药)/10 g(小鼠体质量);葛花解酲汤0.4 g/0.2 g/0.1 g(生药)/10 g(小鼠体质量)，每天1次，正常对照组和模型对照组代以等量蒸馏水;根据前期摸索剂量，给药30 min后，模型对照组和各给药组用56%(V/V)红星二锅头白酒灌胃，0.15 mL/10 g，每天1次，正常对照组代以等量蒸馏水。连续灌胃10 d，所有动物常规饲养。

1.5 小鼠活动状况观察 所有造模小鼠出现嗜睡、步态蹒跚、活性减少、身子发抖等状态，其余小鼠活动正常。

1.6 小鼠血清ALT、AST水平检测 末次灌胃12 h后开始禁食 (不禁水)，24 h后每只小鼠经眼眶采血，低温离心制备血清，按试剂盒要求检测ALT、AST水平。

1.7 小鼠肝组织Caspase3和Caspase8活性检测 各组动物采血后，颈椎脱臼处死，分别取肝脏组织20～40 mg制备组织匀浆，严格按试剂盒说明书操作方法检测小鼠肝组织裂解液中Caspase3/8活性。所有操作尽量在冰浴中进行。

1.8 统计分析 应用SPSS11.5软件进行数据分析，计算结果以均数±标准差 (±s)表示，组间采用t检验。

2 结果

为了便于复方之间的效果分析，各项指标以各方最佳效果剂量组作为参比组。

2.1 3首解酒方对急性酒精中毒小鼠血清ALT、AST水平的影响 检测结果见表1。

(1)模型对照组小鼠血清ALT、AST水平较正常对照组显著升高(P＜0.01)。(2)3首复方最佳效果剂组小鼠鼠血清ALT、AST水平较模型对照组显著降低 (P＜0.01)，但与正常对照组相比明显较高 (P＜0.05或P＜0.01)。(3)葛花解酲汤最佳效果剂量组小鼠血清ALT、AST水平在3首复方中最低，其中ALT水平与其余2首复方差异显著 (P＜0.01)，AST水平与其余2首复方比较无差异显著性 (P＞0.05)。 (4)3首复方最佳效果剂量组小鼠血清ALT、AST水平与最差效果剂量组之间具有显著性差异 (P＜0.01)，但葛花解酲汤各剂量组小鼠之间血清AST水平除外 (P＞0.05)。

表1 3首解酒方对急性酒精中毒小鼠血清ALT、AST水平的影响(±s)

表1 3首解酒方对急性酒精中毒小鼠血清ALT、AST水平的影响(±s)

注:▲为各组除去死亡动物之后实际检测数 (动物死亡原因包括醉死和操作意外死亡);a本指标最佳效果方剂;b本方剂本指标最佳效果剂量;与正常对照组比较，*P ＞0.05，＊＊P＜0.05，＊＊＊P ＜0.01;与模型对照组比较，△ P＞0.05，△△P ＜0.05，△△△P ＜0.01;与本指标最佳效果方剂比较，§P＞0.05，§§P＜0.05，§§§P＜0.01;与本方剂最佳剂量组比较，#P＞0.05，##P＜0.05，###P＜0.01。下同。

组 别 动物/只▲ ALT/(U·L－1) AST/(U·L－1)正常对照组13 53.27 ±6.38 66.95 ±12.65模型对照组 14 177.39±14.17＊＊＊ 138.88±15.97＊＊＊葛根散大剂量组 12 95.34±11.29b＊＊△△△§§§ 100.38±10.26#中剂量组 15 106.23 ±14.87# 95.94 ±13.11b＊＊＊△△△§小剂量组 13 138.71 ±13.63### 130.55±10.20###石膏汤大剂量组 14 101.96 ±11.73b＊＊＊△△△§§§ 89.66±10.71b＊＊＊△△△§中剂量组 13 109.34 ±9.94# 100.33±10.64#小剂量组 13 167.11 ±11.99### 123.08±12.05###葛花解酲汤大剂量组 12 71.82±11.27ab＊＊△△△ 91.33±11.08#中剂量组 15 75.26 ±10.37# 96.40±11.69#小剂量组 13 96.46 ±10.28### 87.63±8.37ab＊＊△△△

2.2 葛根散等3首解酒方对急性酒精中毒小鼠Caspase3/8活性的影响 检测结果见表2。

(1)模型对照组小鼠肝组织Caspase3/8活性较正常对照组显著升高 (P＜0.01)。(2)3首复方最佳效果剂量组小鼠肝组织Caspase3/8活性与模型对照组比较显著降低(P＜0.01)，但石膏汤各组肝组织Caspase3活性除外 (P＞0.05);3首复方最佳效果剂量组小鼠肝组织Caspase3/8活性与正常对照组相比明显较高 (P＜0.01)，但葛花解酲汤各组肝组织Caspase8活性除外 (P＞0.05)。(3)葛根散最佳效果剂量组小鼠肝组织Caspase3活性在3首复方中最低，与其余2首复方差异显著 (P＜0.01);葛花解酲汤肝组织Caspase8活性在3首复方中最低，与其余2首复方差异显著(P＜0.05)。 (4)葛根散和葛花解酲汤剂量组间肝组织Caspase3活性差异显著 (P＜0.01);石膏汤和葛花解酲汤剂量组间肝组织Caspase8活性差异显著 (P＜0.01)。

3 讨论

酒精性肝病 (ALD)是一种由于过度饮酒引起的中毒性肝脏疾病，在我国呈逐年上升趋势，已成为继病毒性肝炎后导致肝损害的第二大病因。近来研究表明，酒精是肝细胞的一种凋亡诱导剂，而肝细胞凋亡ALD的发生、发展过程中起着重要作用，已成为该领域的研究热点之一［6］。在前期研究中，我们初步筛选出本文中葛根散、石膏汤、葛花解酲汤有效解酒防醉、保护酒精导致的肝功能损伤、缓解肝组织病理损害、减少肝细胞凋亡［3-5］。为了深入探索上述解酒方减少肝细胞凋亡的部分机制，本实验通过复制急性酒精中毒小鼠模型，考察上述解酒方对实验动物Caspase3/8活性的影响。Caspases(Cysteinyl asparate specific proteinase)是一种特异性蛋白酶，以执行细胞凋亡而受到广泛关注［1］。Caspase3/8在细胞凋亡过程中发挥重要作用:Caspase8是细胞凋亡的启动者，Caspase3在凋亡过程中处于核心位置，是细胞凋亡的主要效应因子［3-4］。ALT和AST在肝细胞中均有存在，当肝细胞膜受损或细胞坏死时，便进入血液，通过测定其在血清中的活性，即可反映肝细胞受损情况及损伤程度。表1结果显示，模型小鼠血清ALT、AST水平显著升高，提示肝细胞受到严重损伤。

表2 3首解酒方对急性酒精中毒小鼠肝组织Caspase3/8活性 (±s)

表2 3首解酒方对急性酒精中毒小鼠肝组织Caspase3/8活性 (±s)

组别 动物/只 肝组织Caspase3活性/(U·mg pro－1) 肝组织Caspase8活性/(U·mg pro－1)13 1.26±0.27 0.81±0.21模型对照组 14 6.63±0.59＊＊＊ 2.67±0.32＊＊＊葛根散大剂量组 12 2.29±0.61ab＊＊＊△△△ 1.70±0.29#中剂量组 15 3.76±0.51### 1.63 ±0.31b＊＊＊△△△§§小剂量组 13 4.89±0.44### 1.69±0.31#石膏汤大剂量组 14 5.94±0.42#1.61 ±0.29b＊＊＊△△△§§中剂量组 13 5.89±0.40b＊＊＊a§§§ 1.99±0.24#小剂量组 13 6.07±0.52# 2.49±0.21###葛花解酲汤大剂量组 12 2.52±0.39b＊＊＊△△△§§§ 1.09±0.28ab＊△△△中剂量组 15 3.07±0.41# 1.27±0.36#小剂量组 13 4.44±0.45### 1.96±0.30正常对照组###

本实验考察的3首解酒方剂中，葛根散解热生津、健脾和胃，石膏汤解热除烦、生津止渴，葛花解酲汤分消酒湿、温中健脾，三方都主治饮酒过度、酒毒内蕴之证。现代研究表明，乙醇代谢产生的乙醛是使人喝酒后产生行为异常、恶心欲吐、昏迷不适等急性醉酒症状主要原因［6］;而酒精引起肝细胞破坏是导致酒精性慢性肝损害的关键始动因素。我们前期研究显示，上述3方都具有明显醒酒防醉作用，能明显改善实验小鼠昏睡、攀附力量降低、步态蹒跚、身子发抖等“醉酒”表现，其机制可能与其能够明显降低血乙醇水平和保护肝细胞的作用密切相关［3-5］。研究表明，反复肝细胞损伤是导致酒精性慢性肝损害的重要机制，而酒精引起肝细胞异常凋亡是其损害肝细胞的重要方面;中医药能有效醒酒防醉，治疗饮酒过度、酒毒内蕴之证，同时对慢性酒精性肝病远期疗效较好［7-8］。因此，中药防治慢性酒精性肝损伤是否与其缓解肝细胞凋亡、保护肝细胞有关，就成了研究解酒中药远期疗效机制的核心内容之一。在我们考察3首解酒方保护肝细胞的机制时，发现它们可以明显缓解肝细胞凋亡水平［5］。本实验表2结果显示，3首解酒方均能显著降低模型小鼠肝组织Caspase3/8活性，提示3首复方具有抑制肝细胞凋亡的机制与其降低Caspase3/8活性有关。从3方不同剂量干预模型小鼠肝组织Caspase3/8活性能力的差异，提示其效应具有剂量依赖性。总之，本实验初步观察到葛根散等3首解酒方对急性酒精中毒小鼠肝组织Caspase3/8活性具有不同程度抑制作用，为深入研究各方解酒防醉、防治慢性酒精性肝病积累了一定的实验依据。

［1］Green DR.Apoptotic pathways:the roads to ruin［J］.Cell，1998，94(6):695-698.

［2］岳原亦，张 扬，张一奇.Caspase家族与细胞凋亡［J］.中国医疗前沿，2011，6(6):25-26.

［3］杨 柱，田维毅，王文佳.5首解酒方对小鼠醉酒模型解酒效应的比较研究［J］.中成药，2010，32(11):1969-1972.

［4］杨 柱，田维毅，王文佳，等.葛根散等3首解酒方对乙醇致小鼠急性肝损伤的保护作用［J］.辽宁中医药大学学报，2010，12(4):7-9.

［5］俞 琦，王 平，王文佳.葛根散等3首解酒方对急性酒精中毒小鼠肝细胞凋亡的影响［J］.中华中医药杂志，2011，26(9):2046-2048.

［6］庄 辉.酒精性肝病的流行病学［J］.中华肝脏病杂志，2003，11(11):698.

［7］胥遥山，李永娟.酒精影响个体社会行为的机制［J］.心理科学进展，2011，19(4):565-572.

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