大蒜硝黄膏穴位贴敷治疗大鼠不完全性肠梗阻的药效学研究

马晓莉， 王 淼， 韩 波， 曹松云， 张新颖， 曲 萌

(河北大学中医学院，河北保定071000)

肠梗阻是外科常见的急腹症之一，不仅可以引起消化道局部损伤、全身性生理紊乱，严重的可导致毒血症、休克、死亡。中西医结合治疗一般是在西医保守治疗的基础上，加用中药内治或针灸等方法，取得良好的疗效，作用机制的研究已比较深入［1-3］。大蒜硝黄膏方源自《中医天灸疗法》，药物组成为大蒜、芒硝、生大黄，用陈醋适量制成膏，敷于神厥穴治疗肠梗阻［4］。穴位贴敷治疗肠梗阻的优势在于可以早期介入，减少并发症的发生，缩短病程。本实验通过观察大蒜硝黄膏穴位贴敷对不完全性肠梗阻模型大鼠的影响，探讨其作用机理，为临床应用提供依据。

1 材料

1.1 动物 SD大鼠48只，雌性，体质量(230±50)g，清洁级，购自河北省实验动物中心，合格证编号:1103189。

1.2 药物与试剂

1.2.1 大蒜硝黄膏的制备 先将大黄30 g研为细粉，再与大蒜120 g、芒硝30 g共捣融，调醋60 mL为糊，分别按7.5 g、5 g、2.5 g制成直径5.5 cm、3.5 cm、2.5 cm的高、中、低剂量的圆形药饼，作为备用 (膏-1)。另将大黄60 g研为细粉，加醋适量调成大黄糊，再分别按7.5 g、5 g、2.5 g制成直径5.5 cm、3.5 cm、2.5 cm的高、中、低剂量的圆形药饼，作为备用 (膏-2)。

1.2.2 主要试剂 NO检测试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号:20110106;SOD试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号:20110107;MDA试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号:20110106。

1.3 仪器 Stat Fax-2100酶标仪，美国Awareness公司;KD-2258轮转式切片机，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司;BS224S电子天平，赛多利斯科学仪器 (北京)有限公司;SHA-BA双功能水浴恒温振荡器，金坛市杰瑞尔电器有限公司;Polytron PT 2100标准台式匀浆机，瑞士Kine-matica公司;MVIS-2015全自动血液流变分析仪，重庆天海医疗商务有限公司。

2 方法

2.1 不完全性肠梗阻模型制备 依据参考文献［5］调整施行。将大鼠禁食12 h、禁水4 h，用10%水合氯醛 (350 mg/kg)麻醉，备皮后碘伏消毒，于左侧腹壁开腹，暴露回盲部，用中心静脉导管与回肠肠管并排放置，在距回盲部2 cm处用圆针带丝线穿透肠系膜绕过回肠肠管和中心静脉导管一并结扎，最后抽出中心静脉导管，造成不完全性肠梗阻，然后将腹壁逐层缝合，术后常规喂养。

2.2 分组与给药 将大鼠随机分为正常对照组、手术模型组、阳性对照组、大蒜硝黄膏高、中、低剂量组，每组8只，喂饲普通饲料。由于目前临床上没有疗效确切的治疗肠梗阻的外用中成药，因此选取大承气汤口服作为阳性对照。除正常对照组外各组大鼠均于手术造模苏醒后给药。阳性对照组灌胃大承气汤10 mL/kg，(每1 mL含生药1 g)，连续喂3 d。大蒜硝黄膏高、中、低剂量组分别将膏-1贴敷于大鼠的神阙穴，胶布固定，2 h后去掉膏-1，用温开水洗净局部皮肤，然后再将膏-2敷于神阙穴，胶布固定，贴敷6 h，连续贴敷3 d。正常组、手术模型组仅贴敷胶布，给予相同刺激。大鼠神阙穴依据《实验针灸学》［6］中大鼠针灸穴位分布图及定位方法进行定位。

2.3 标本处理 造模72 h后下腔静脉取血，一部分用于血液流变学检测，一部分置于含3.8%的枸橼酸钠真空管中3000 r/min离心10 min，取血浆于－70℃冷存，用于NO、MDA和SOD的测定。取血后立即处死动物，即刻剪取距回盲部2 cm处的小肠组织，以生理盐水轻柔冲洗肠腔内容物后，无菌滤纸吸干水分，一部分浸泡于10%甲醛中固定24～48h后用于常规HE染色，另一部分置于－70℃冰箱保存，用于NO、SOD、MDA的测定。

2.4 观察指标

2.4.1 一般情况 观察造模前后大鼠的一般状况和体质量的变化。

2.4.2 小肠组织形态学观察 将10%甲醛固定24～48 h后的小肠组织常规石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察其形态学改变。并根据Haglund等［7］方法评价肠黏膜损伤程度。标准如下:0分，绒毛和腺体正常;1分，部分绒毛顶部上皮轻度受损;2分，上皮下腺体轻度受损;3分，上皮下间隙扩大，毛细血管充血;4分，上皮与固有层中度分离，腺体受损;5分，部分绒毛顶部脱落;6分，绒毛明显脱落;7分，固有层绒毛脱落;8分，固有层开始消化分解;9分，出血、溃疡生成。

2.4.3 血液流变学检测 使用MVIS-2015全自动血液流变分析仪检测。

2.4.4 血浆与小肠组织NO、MDA、SOD的测定 采用黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶 (SOD);硝酸还原酶法测定NO;硫代巴比妥酸法 (TBA)测定MDA，具体操作过程详见说明书。

2.5 统计学处理 应用SPSS16.0软件进行处理，小肠黏膜损伤评分采用秩变换非参数检验分析，均数间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 对不完全性肠梗阻大鼠一般情况的影响 模型组大鼠神态倦怠，反应迟钝，毛色黯淡无光，被毛杂乱，体质量明显下降;与模型组相比，大蒜硝黄膏组和阳性对照组大鼠一般状态良好，体质量下降程度明显降低 (P＜0.01)，其中以大蒜硝黄膏高剂量组体质量下降最少;大蒜硝黄膏高、中、低剂量组与阳性对照组相比，无显著差异 (P＞0.05);大蒜硝黄膏高、中、低剂量组组间无显著差异(P＞0.05)。表明大蒜硝黄膏穴位贴敷能改善梗阻大鼠的一般状态。结果见表1。

表1 对不完全性肠梗阻大鼠实验前后体质量差值的比较(±s)

表1 对不完全性肠梗阻大鼠实验前后体质量差值的比较(±s)

注:与正常对照组比较，＊＊P ＜0.01;与模型组比较，##P ＜0.01。

/g正常对照组 8 239.46±7.18 244.46±5.62 5.00±3.31组 别 动物数/只 实验前体质量/g 实验后体质量/g 体质量差值##手术模型组 8 249.01±14.19 212.58±13.23 －36.74±4.50＊＊阳性对照组 8 253.65±13.39 231.88±12.87 －21.78±2.58＊＊##大蒜硝黄膏高剂量组 8 241.02±12.18 220.25±14.18 －20.78±3.75＊＊##大蒜硝黄膏中剂量组 8 240.24±7.47 218.00±7.90 －22.24±2.66＊＊##大蒜硝黄膏低剂量组 8 242.16±8.77 218.71±10.61 －23.45±4.42＊＊##

3.2 对不完全性肠梗阻大鼠小肠组织形态学的影响 光镜下，HE染色发现模型组小肠黏膜上皮细胞肿胀，细胞界限不清，黏膜下层、肌层及浆膜层明显瘀血，上皮细胞坏死、脱落，绒毛水肿、破损、脱落明显，固有层血管充血;大蒜硝黄膏组和阳性对照组大鼠小肠上皮细胞充血、水肿减轻，坏死减少，炎细胞浸润明显减少，小肠绒毛破损程度减轻，见图1。模型组小肠黏膜损伤评分增加，大蒜硝黄膏高、中、低剂量组小肠黏膜损伤评分显著低于模型组，结果见表2。

图1 对不完全性肠梗阻大鼠小肠组织形态学的影响 (×100)

表2 对不完全性肠梗阻大鼠小肠黏膜损伤评分的比较

3.3 对不完全性肠梗阻大鼠血液流变学的影响 模型组大鼠的全血低切、高切黏度、血浆黏度和红细胞聚集指数明显高于正常组 (P＜0.01);与模型组相比，大蒜硝黄膏高、中、低剂量组和阳性对照组大鼠全血低切、高切黏度、血浆黏度和红细胞聚集指数均有显著降低，其中高剂量组降低最多。大蒜硝黄膏高、中、低剂量组与阳性对照组相比，无显著差异 (P＞0.05)，大蒜硝黄膏高、中、低剂量组组间无显著差异 (P＞0.05)。提示大蒜硝黄膏可以改善梗阻时血液的高黏滞状态，结果见表3。

表3 对不完全性肠梗阻大鼠血流变学指标的比较 (±s)

表3 对不完全性肠梗阻大鼠血流变学指标的比较 (±s)

注:与正常对照组比较，＊＊P＜0.01;与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组 别 动物数/只 全血黏度低切3s/(mPa·s)全血黏度高切200s/(mPa·s)血浆黏度/(mPa·s)红细胞聚集指数(Arbc)正常对照组 8 11.19±0.86## 5.39±0.55## 1.18±0.06## 6.36±0.49##手术模型组 8 14.22±0.35＊＊ 7.30±0.46＊＊ 1.80±0.13＊＊ 8.95±0.78＊＊阳性对照组 8 13.55 ±0.38＊＊# 6.61 ±0.18＊＊## 1.63 ±0.08＊＊## 8.00 ±0.67＊＊##大蒜硝黄膏高剂量组 8 13.52 ±0.68＊＊# 6.60 ±0.40＊＊## 1.62 ±0.07＊＊## 8.05 ±0.53＊＊##大蒜硝黄膏中剂量组 8 13.56 ±0.54＊＊# 6.64 ±0.28＊＊## 1.64 ±0.08＊＊## 8.19 ±0.67＊＊#大蒜硝黄膏低剂量组 8 13.79±0.54＊＊ 6.66±0.29＊＊## 1.70±0.05＊＊# 8.37±0.60＊＊

3.4 对不完全性肠梗阻大鼠血浆及小肠组织NO、MDA、SOD水平的影响 模型组血浆和小肠组织NO、MDA水平明显增高，SOD水平明显降低 (P＜0.01);与模型组相比，大蒜硝黄膏组和阳性对照组血浆和小肠组织NO、MDA水平增高的程度降低，SOD水平有不同程度的升高 (P＜0.05)，其中以大蒜硝黄膏高剂量组效果最好。大蒜硝黄膏高、中、低剂量组与阳性对照组相比，无显著差异 (P＞0.05)，大蒜硝黄膏高、中、低剂量组组间无显著差异(P＞0.05)。表明大蒜硝黄膏可以明显降低模型大鼠血浆和小肠组织的NO、MDA水平、升高SOD水平，具有清除氧自由基、拮抗脂质过氧化反应的作用。结果见表4、5。

表4 对不完全性肠梗阻大鼠血浆NO、MDA、SOD的影响 (±s)

表4 对不完全性肠梗阻大鼠血浆NO、MDA、SOD的影响 (±s)

注:与正常对照组比较，＊＊P＜0.01;与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组 别 动物数/只 NO/(μnmoL·L－1) MDA/(nmoL·mL－1) SOD/(U·mL－1)正常对照组 8 30.22±0.83## 4.56±0.42## 213.36±8.49##手术模型组 8 45.09±1.33＊＊ 8.75±1.02＊＊ 158.30±4.96＊＊阳性对照组 8 39.12 ±1.35＊＊## 6.80 ±0.63＊＊## 170.49 ±8.72＊＊##大蒜硝黄膏高剂量组 8 38.99 ±1.48＊＊## 6.44 ±0.73＊＊## 172.10 ±7.11＊＊##大蒜硝黄膏中剂量组 8 39.86 ±1.30＊＊## 7.06 ±1.26＊＊## 169.23 ±6.97＊＊##大蒜硝黄膏低剂量组 8 40.42 ±2.11＊＊## 7.31 ±1.01＊＊## 167.03 ±5.34＊＊#

表5 对不完全性肠梗阻大鼠小肠组织NO、MDA、SOD的影响 (±s)

表5 对不完全性肠梗阻大鼠小肠组织NO、MDA、SOD的影响 (±s)

注:与正常对照组比较，＊＊P＜0.01;与模型组比较，##P＜0.01。

组 别 动物数/只 NO/(μnmoL·gprot－1) MDA/(nmoL·mgprot－1) SOD/(U·mgprot－1)正常对照组 8 19.88±0.85## 3.69±1.02## 83.62±8.30##手术模型组 8 28.99±0.83＊＊ 7.59±0.65＊＊ 49.52±5.15＊＊阳性对照组 8 24.28 ±0.97＊＊## 5.99 ±0.96＊＊## 66.35 ±7.91＊＊##大蒜硝黄膏高剂量组 8 23.98 ±1.56＊＊## 5.88 ±0.83＊＊## 68.59 ±9.02＊＊##大蒜硝黄膏中剂量组 8 24.95 ±1.20＊＊## 6.02 ±0.69＊＊## 65.42 ±8.72＊＊##大蒜硝黄膏低剂量组 8 25.03 ±1.19＊＊## 6.19 ±1.06＊＊## 62.35 ±8.19＊＊##

4 讨论

肠梗阻按梗阻程度不同分完全性肠梗阻和不完全性肠梗阻［8-9］，不完全性肠梗阻亦能演变为完全性肠梗阻，因此临床上应早诊断、早治疗、避免拖延时间加重病情［10］。肠梗阻发生后，一系列理化因素作用于肠道组织，导致肠管缺血、水肿、微循环障碍，血液黏度增加，进一步引起肠道的运动、吸收及分泌等功能代谢异常，导致大量相关介质如NO大量释放，产生氧自由基等有害物质，氧自由基的分解产物之一MDA又可引起蛋白质变性和交联，使DNA损伤、酶及激素失活，随着氧自由基的不断增多，机体内清除自由基的酶类如超氧化物歧化酶 (SOD)等活性不足或抗氧化剂不足时，则引起周围组织的严重破坏性损伤，使炎症和组织损伤之间形成恶性循环［11-12］。因此改善肠道微循环、降低NO、清除氧自由基，保护小肠黏膜组织是治疗肠梗阻的重要机制。

有文献报道，大蒜中所含大蒜素具有扩血管、抗缺血、抗血小板聚集和清除氧自由基的作用，能提高机体免疫力［13］;外用芒硝可使胃窦、结肠近端肌间神经丛SP的分布明显增加，从而增强胃肠壁内神经元的兴奋性，促进胃肠活动［14］;大黄能促进胃肠平滑肌运动，不仅能降低血液黏度和红细胞聚集，并且具有抗超氧阴离子、清除氧自由基的作用［15-16］，另外对MDA也有明显抑制作用，且抑制作用有明显的量效关系［17］。

探讨大蒜硝黄膏穴位贴敷治疗不完全性肠梗阻的作用机制，选取上述肠梗阻病理生理过程中比较有代表意义的血流变学和NO、MDA、SOD等作为检测指标。实验结果表明，大蒜硝黄膏穴位贴敷使模型大鼠血液黏滞程度、血浆和小肠组织的NO、MDA水平明显降低，SOD水平明显增高，使小肠组织损伤明显减轻，保护肠黏膜结构的完整性，具有肠屏障保护功能。

实验中大蒜硝黄膏贴敷方法按原文献使用方法，即将方中膏-1贴敷2 h后，换膏-2继续贴敷6 h。膏-1中的大蒜具有皮肤刺激性，不宜贴敷时间过长，以免损伤皮肤。

穴位贴敷法治疗肠梗阻的优势在于简单易行，可以早期介入，增强疗效，减少并发症的发生，缩短病程，值得临床推广应用。

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