灵芝孢子粉对戊四氮致痫大鼠Caspase-3、NO、NOS的影响

李 晶， 于海波， 于海涛， 王淑秋， 王伟群， 贾琳琳

(1.佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯154002;2.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯154002)

癫痫发病机制错综复杂，大量研究发现，一氧化氮(NO)与一氧化氮合酶 (NOS)参与了癫痫的点燃［1］，而脑损伤的另一途径是持续存在的细胞凋亡。研究癫痫的靶区通常选择颞叶皮质和海马区［2］，因其是中枢神经系统内对癫痫最敏感的脑区。本研究观察灵芝孢子粉对戊四氮致痫大鼠脑组织Caspase-3、NO、NOS水平的影响，探讨其作用机理，为灵芝孢子粉中药资源的深入开发提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料 雄性Wistar大鼠 (10周龄，佳木斯大学实验动物中心，黑动字第99102001号);戊四氮 (PTZ，美国Sigma公司，10 g/L溶液双蒸水配制);灵芝孢子粉(佳木斯市野生灵芝种植基地，30 g/L溶液双蒸水配制);SABC试剂盒、PBS及枸橼酸钠缓冲液、多聚赖氨酸、Caspase-3多克隆抗体 (武汉博士德公司);JA型电子精密天平 (上海衡平科学仪器有限公司);DAB显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司);BI-2000医学图像分析系统 (成都泰盟生物科技公司);NO、NOS试剂盒 (南京建成生物工程研究所)。

1.2 实验方法 30只雄性Wistar大鼠，随机分成3组，每组10只，分别是正常组 (生理盐水腹腔注射+生理盐水灌胃);模型组 (戊四氮腹腔注射+生理盐水灌胃);用药组(戊四氮腹腔注射+灵芝孢子粉灌胃)。32 mg/kg为戊四氮腹腔注射剂量 (亚惊厥剂量)，150 mg/kg为灵芝孢子粉灌胃剂量。每天上午11点进行，1次/d(灌胃前禁食6 h，持续28 d)。

1.3 癫痫发作行为学观察 癫痫发作评分标准:0级，无反应;Ⅰ级，点头/甩尾;Ⅱ级，须动/头面抽动;Ⅲ级，前肢/后肢抽动;Ⅳ级，全身抽动;Ⅴ级，窜动;Ⅵ级，全面性强直-阵挛发作。癫痫造模成功为连续5次Ⅱ级或Ⅱ级以上惊厥发作［3］。

1.4 检测指标 模型建成后 (在每次注射戊四氮后观察大鼠行为表现，且注射剂量及时间28 d内保持恒定)，乙醚吸入麻醉 (注意剂量)，断头取脑组织 (分离出皮质、海马)，10%甲醛固定24h，常规石蜡包埋。取一半皮质、海马做6 μm切片，行SABC法Caspase-3免疫组化染色。另一半皮质、海马称质量后配成10%匀浆液 (加生理盐水)，4000 r/min离心，时间15 min，取上清液检测NO、NOS水平，操作按照试剂盒说明。

1.5 统计学处理 SPSS软件分析所有数据，计量资料以均数±标准差 (±s)表示，差别有统计学意义为P＜0.05，组间比较先用方差分析，再用t检验。

2 结果

2.1 动物模型行为表现 正常组无任何行为异常，模型组、用药组有连续多次的Ⅲ～Ⅴ级癫痫发作 (注射戊四氮后3 min左右出现，达到高峰一般需要7 min，通常20 min后很少再有抽搐发作)，组间差异无显著性，见表1。

表1 各组大鼠抽搐强度的比较 (±s，n=10)

表1 各组大鼠抽搐强度的比较 (±s，n=10)

注:与正常组比较，*P＜0.05;与用药组比较，#P＞0.05。

分组 Ⅰ级 Ⅱ级 Ⅲ级 Ⅳ级 Ⅴ级 Ⅵ级0 0 0 0 0 0模型组 － － 4* 2# 2 2用药组 1 3*正常组5 1 0 0

2.2 对癫痫脑组织Caspase-3、NO、NOS的影响 模型组皮质、海马Caspase-3表达增加，海马相对皮质增加更显著。Caspase-3表达主要在胞浆，少部分在胞核 (棕黄色颗粒是阳性细胞，其计算采取随机原则)。皮质各层弥散分布，海马分布在锥体细胞层及颗粒细胞层。

脑组织 NO、NOS水平，正常组低于用药组 (P＜0.05);用药组低于模型组 (P＜0.05)，见表2。

表2 各组大鼠皮质和海马区Caspase-3阳性细胞数及NO水平、NOS活性变化 (±s，n=10)

表2 各组大鼠皮质和海马区Caspase-3阳性细胞数及NO水平、NOS活性变化 (±s，n=10)

注:与正常组比较，*P＜0.05;与模型组比较，#P＜0.05。

分组颞叶皮质Caspase-3 NO/(μmol·L－1) NOS/(U·g－1) Caspase-3 NO/(μmol·L－1) NOS/(U·g－1海马)正常组 82.40±2.89 4.15±0.49 0.24±0.03 51.30±2.83 4.56±1.31 0.23±0.07模型组 149.70±5.12* 12.54±3.09* 0.67±0.12* 111.10±5.45* 11.49±2.63* 0.58±0.10*用药组 122.90±4.51# 6.45±1.61# 0.28±0.09# 78.30±5.42# 6.86±2.27# 0.29±0.05#

3 讨论

戊四氮所致癫痫与人类自发性癫痫极为相似，可在某种程度上反映人类癫痫的不同特征［4］。且其本身没有神经毒性，不破坏脑组织，是制备癫痫模型常用化学制剂［5］。

研究发现，气体神经递质NO是中枢神经系统的可逆信使，其生物合成调节最关键的因素是NOS［6］。本研究显示，模型组NO水平、NOS活性增高，说明NO、NOS参与癫痫发作。灵芝孢子粉可降低NO、NOS的水平及活性，减轻NO、NOS对脑组织 (皮质及海马)损害，具有显著的抗痫作用。

在细胞凋亡的分子机制网络中居中心地位的是可使凋亡细胞解体的Caspase家族 (也称死亡蛋白酶、关键蛋白酶)。caspase-3激活参与癫痫发作后的神经元凋亡［7］。作用于其他的caspase家族成员，凋亡细胞中的某些成分被降解，放大蛋白酶级联反应，使细胞最终走向凋亡［8］。本研究中模型组Caspase-3表达水平 (皮质及海马)增加，尤以海马增加更明显 (可能海马较皮质更为敏感)。

本研究结果显示，灵芝孢子粉能减少Caspase-3的表达，降低脑组织中 NO、NOS水平。可能通过调节Caspase-3、NO、NOS水平、改善神经电生理功能 (皮质及海马)，降低神经系统的兴奋性，减轻神经细胞的凋亡，调节神经递质保护神经元［9］。充分显示了中医中药对癫痫治疗研究的潜在优势和广阔前景。

［1］李春香，于 明，唐宁波，等.戊四唑致癫痫大鼠脑组织NO和MDA含量及其相关性研究［J］.临床神经病学杂志，2002，15(2):100-101.

［2］谢 炜，于云红，赵云燕，等.同病异治复方对戊四氮慢性点燃大鼠痫性发作的影响［J］.辽宁中医杂志，2010，37(10):1898-1900.

［3］张丽萍，王进声，陈 青，等.戊四唑致痫模型大鼠脑神经元损害及宁痫颗粒的干预作用［J］.山东中医杂志，2004，23(10):619-620.

［4］Qu H，Eloqayli H，Sonnewald U.Pentylenetetrazole affects metabolism of astrocytes in culture［J］.J Neurosci Res，2005，79(1-2):48-54.

［5］Erdogan F，Golgeli A，Arman F，et al.The effects of pentylenetetrazole-induced status epilepticus on behavior，emotional memory，and learning in rats［J］.Epilepsy Behav，2004，5(3):388-393.

［6］陈燕惠.一氧化氮在癫痫和学习中的作用［J］.国外医学生理病理科学与临床分册，2000，20(1):76-78.

［7］Henshall D C，Chen J，Simon R P.Involvement of caspase-3-like protease in the mechanism of cell death following focally evoked limbic seizures［J］.J Neurochem，2000，74(3):1215-1223.

［8］赵 爽，康玉明，张胜昌.灵芝孢子粉对癫痫大鼠脑IGF-1、NF-κB表达及神经细胞凋亡的影响［J］.中国病理生理杂志，2007，12(6):1153-1156.

［9］赵 爽，张胜昌，王淑秋.灵芝孢子粉对癫痫大鼠脑NF-κB免疫反应性影响及行为学观测［J］.右江民族医学院学报，2008，12(6):240.