野山参中7种人参皂苷的测定

张 静， 张 聪*， 胡 馨， 蔡国琴， 张英华， 邓捷圆

(1.上海中医药大学，上海201203;2.上海市中药研究所，上海201204)

野山参Panax ginseng C.A.Mey.为五加科人参属植物，具有大补元气、益肺、生津、安神等功效［1］。野山参是我国的传统名贵药材，其药用历史源远流长。现代药物学研究已证明人参皂苷(ginsenosides)是其主要活性成分，因此含人参皂苷量的多少是评价人参内在质量的重要指标［2］。本研究采用高效液相色谱法对野山参中的7种主要人参皂苷成分进行了测定，有利于更全面、有效地控制野山参药材的质量。

1 仪器和试药

1.1 仪器 Agilent 1200系列高效液相色谱仪 (美国安捷伦公司)，包括 G1322A真空脱气机、G1311A四元泵、G1329A自动进样器、G1316A柱温箱和G1314B DAD检测器;超声波清洗器 (JIE 360型，上海杰理科技有限公司)。

1.2 药品和试剂 人参皂苷对照品Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd购自中国药品生物制品检定所。野山参样品由上海雷允上神象分公司提供，由副主任中药师李跃雄、吴咏梅鉴定，为五加科Araliaceae植物Panax ginseng C.A.Meyer的干燥根茎，并为野生者。乙腈和甲醇为色谱纯 (Fisher，USA)，正丁醇为分析纯，水为Millipore纯水。

2 方法和结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取人参皂苷对照品 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd，分别为 1.22、1.62、0.43、 2.50、0.93、 1.01、 0.52 mg/mL， 置5mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得质量浓度分别为 0.244、0.324、0.086、0.500、0.186、0.202、0.104 mg/mL的混合对照品溶液，置于4℃冰箱保存。

2.1.2 野山参药材样品溶液的制备 精密称取野山参药材粉末 (过三号筛)约1.0 g，置索氏提取器中，加70 mL三氯甲烷水浴回流3 h，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，连同滤纸移入100 mL锥形瓶中，精密加入水饱和正丁醇60 mL，密塞，放置过夜，超声处理15 min，滤过，弃去初滤液，精密量取滤液30 mL，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2 色谱条件

2.2.1 色谱条件Ⅰ 用于测定人参皂苷Rg1、Re。流动相为乙腈-水 (21∶79)，等度洗脱;柱温30℃;检测波长203 nm;体积流量1 mL/min，进样量10 μL。色谱图见图1。

图1 色谱条件Ⅰ下对照品 (A)与样品 (B)图谱Fig.1 References(A)and sample(B)spectrum of test methodⅠ

2.2.2 色谱条件Ⅱ 用于测定人参皂苷Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd。流动相A为乙腈，流动相B为水梯度洗脱，0～25 min(28%A)，25～35 min(28% ～30%A)，35～45 min(30% ～32%A)，45～60 min(45% ～60%A);Eclipse Plus C18色谱柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);柱温30℃;检测波长203 nm;体积流量1 mL/min，进样量10 μL，见图2。

3 方法学考察

图2 色谱条件Ⅱ下对照品 (A)与样品 (B)图谱Fig.2 References(A)and sample(B)spectrum of test methodⅡ

3.1 线性关系考察 分别取混合对照品溶液1、2、4、8、12 μL进样，按色谱条件Ⅰ测定;分别取混合对照品溶液1、2、4、8、12 μL进样，按色谱条件Ⅱ测定，以进样量 (μL)为横坐标，含药量 (μg)为纵坐标，绘制工作曲线。结果 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd的回归方程分别为 :Y=273.79X－6.8464，r=0.9999;Y=241.81X+33.911，r=0.9999;Y=287.97X+0.1368，r=0.9999;Y=204X+6.0269，r=0.9999;Y=202.65X－1.1632，r=0.9999;Y=194.52X－1.5755，r=0.9999;Y=246.03X+0.5252，r=0.9999。线性范围分别为1.50～18.02 μg，2.02～ 24.24 μg，0.25 ～ 3.05 μg，1.34 ～ 16.08 μg，0.70 ～8.42 μg，0.71 ～8.50 μg，0.30 ～3.57 μg。

3.2 精密度试验 取8号样品溶液，按色谱条件Ⅰ测定，重复进样5次测定，结果人参皂苷Rg1、Re色谱峰面积的RSD值均小于2%;按色谱条件Ⅱ测定，重复进样5次测定，结果人参皂苷Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd色谱峰面积的RSD值均小于3%。

3.3 重复性试验 取8号样品，平行制备5份样品溶液，按色谱条件Ⅰ测定，结果人参皂苷Rg1、Re的RSD值均小于3%;按色谱条件Ⅱ测定人参皂苷 Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd 的 RSD 值均小于3%。

3.4 稳定性试验 取8号样品同一溶液，按色谱条件Ⅰ和Ⅱ分别于0、2、4、8、10、12 h测定色谱峰面积，结果人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd色谱峰面积的RSD均小于3%。

3.5 加样回收率试验 精密称取已知含有量的同一批次野山参样品1 g共9份，每3份为1组，分别按样品中各人参皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd含有量的80%、100%、120%精密加入对照品溶液，按2.1.2项下制备，分别按色谱条件Ⅰ和Ⅱ进样分析，记录色谱峰，各人参皂苷回收率的结果为97.06%、98.37%、98.71%、98.88%、100.43%、98.80%，RSD分别为 0.51%、1.88%、2.13%、0.98%、1.43%、0.61%、1.73%。

4 样品测定

按2.1.2项下方法制备18批野山参药材样品溶液，按2.2项下色谱条件进样分析，结果见表1。

表1 18批野山参样品中7种人参皂苷的测定结果 (n=2)Tab.1 Determination results of ginsenosides in wild ginseng(n=2)

5 讨论

5.1 超声提取部分的正交试验 对于超声提取，本实验选择L9(34)表，考察了3个因素，每个因素3个水平;溶剂种类考察了甲醇、70%乙醇、水饱和正丁醇;溶剂体积考察了50、60、70 mL;超声时间考察了15、30、45 min。结果表明水饱和正丁醇的提取效率最高，体积以60 mL最佳，而超声时间的影响不大，所以采用以1 g样品中加入水饱和正丁醇60 mL提取15 min作为最佳前处理条件。正交试验结果见表2。

表2 正交试验结果Tab.2 Results of orthogonal experiment

5.2 提取方法的选择 参考2010年版《中国药典》，考察了正丁醇超声之前采用三氯甲烷回流除杂，结果发现除杂后得到的总皂苷含有量18.26 mg/g，低于直接用正丁醇超声得到的18.33 mg/g，但考虑到脂溶性成分对人参皂苷分离的影响，最终选择了三氯甲烷回流法［3-4］。另外还考察了C18小柱对提取的影响，发现效果不明显，所以未采用C18小柱对样品进行除杂。

5.3 液相条件的选择

5.3.1 色谱柱的选择 考察了Eclispe Plus C18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)、Eclispe XDB C18柱(4.6 mm × 150 mm，5 μm)和 Zorbax C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)3种不同规格的柱子，结果发现，虽然短柱可以缩短分析时间，但不能获得良好的分离度，所以选择 Eclispe Plus C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)。

5.3.2 流动相的选择 比较了甲醇-水、乙腈-水和90%乙腈-水系统，乙腈-水的分离效果最好［5-7］。由于人参皂苷类成分的最佳紫外吸收波长为203 nm，接近末端吸收，在流动相中加入甲酸或乙酸等含羰基的有机酸会明显造成基线波动，而加入磷酸对整体分离情况没有明显影响，最终选择乙腈和纯水作为最佳流动相［8］。

5.3.3 流动相比例的选择 选择合适的流动相比例是分离的关键，由于很难使多种人参皂苷在同一流动相系统中达到良好的分离［9］，同时，Rg1、Re极性非常相似，曾有多篇单独分离这两种成分的报道［10-12］，因此本实验单独将这2种人参皂苷采用一种流动相比例，其他5种人参皂苷采用梯度洗脱方法，使其均达到良好的分离度。

本实验对18个批次的野山参药材中7种皂苷成分进行了测定，方法学考察表明，重复性、稳定性、精密度和加样回收率的范围均符合相关标准。结果表明，在本研究介绍的供试品制备方法和色谱条件下，人参皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd分离良好，所建立的方法稳定可靠，可以用来对野山参进行质量控制。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:8.

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