槲皮素对糖尿病大鼠肾脏组织的保护作用及其调控机制的研究

周方敏 来 芳 黄振步

糖尿病肾病(DN)是指糖尿病微血管病变导致的肾小球硬化，又称糖尿病肾小球硬化症，是糖尿病最常见的并发症，也是引起终末期肾病(ESRD)的主要原因之一。研究表明，周期素激酶抑制剂P27增多在DN肾功能损害中起重要作用[1]。槲皮素作为具有多种生物活性的黄酮类化合物，对糖尿病和慢性肾衰竭大鼠肾功能具有保护作用，可减少糖尿病大鼠的蛋白尿[2-3]，但机制不甚明确。为了进一步探求槲皮素对DN的保护作用机制及进一步明确P27在肾小管上皮细胞表达的意义，本研究拟对槲皮素对DN肾小管上皮细胞表达P27的影响进行体外研究。报道如下：

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 链脲佐菌素和槲皮素均为美国Sigma公司产品；盐酸贝那普利为北京诺华有限公司产品(批号：X1036)；大鼠抗P27多克隆抗体(产品编号：BA0273)、DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司；即用型免疫组化Elivision TM plus试剂盒(产品编号：KIT-9901)、EDTA抗原修复液(产品编号：MVS-0098)均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2 实验动物 健康SD大鼠，雄性，清洁级，体重180～200g，50只，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司，由温州医学院实验动物中心提供。实验期间，动物房室温控制在25～28℃，湿度45%，明暗周期12h/12h。

1.3 实验动物模型制备及分组 参考Yokozawa等[4]报道的方法制备模型：用0.3%戊巴比妥钠溶液以1ml/100g腹腔注射麻醉，常规备皮消毒，从距左脊肋骨1.5cm处作斜向外方切口背部切口，长约2cm，逐层剪开皮肤、肌肉、筋膜，暴露左肾，剥离肾包膜，止血钳夹住肾动脉、输尿管并结扎，剪下左肾，分层缝合腹膜、肌肉、皮肤，并在伤口处滴0.01ml庆大霉素，以预防术后伤口感染。2周后，按55mg/kg单次腹腔注射链脲佐菌素。72h后尾尖取血，测空腹血糖，将血糖≥16.7mmol/L、尿量大于对照组的50%作为糖尿病肾病动物模型建立标准，成功制备40只模型大鼠。分组:①假手术组(SO组，n=10)，SO组只暴露左侧肾脏后再放回腹腔，关闭腹腔，分层缝合;②模型组(M组，n=10);③槲皮素组(Q组，n=10):槲皮素100mg/(kg·d)灌胃;④盐酸贝那普利组(B组，n=10):盐酸贝那普利20mg/(kg·d)灌胃。假手术组和模型组灌服等量生理盐水，连续给药共8周。

1.4 观察指标及方法

1.4.1 体重、肾重及肾重/体重比 每周称量体重，观察并记录，取材时称肾重，并计算肾脏肥大指数[KHI＝右侧肾重(g)/体重(g)]。

1.4.2 尿微量白蛋白和β2-微球蛋白 代谢笼中收集24h尿液标本，采用ELISA法检测尿微量白蛋白和β2-微球蛋白。

1.4.3 生化指标检测 采用全自动生化分析仪检测血清尿素氮、肌酐水平。

1.4.4 肾脏组织形态学检查 取同一肾组织，常规固定，石蜡切片，HE染色，在普通光镜下观察肾脏组织形态学改变情况。

1.4.5 免疫组织化学法检测P27的表达 取同一肾组织，采用Elivison二步法，按试剂盒说明书要求操作。结果判断：免疫组织化学方法染色后，将所制切片在光学显微镜下观察，细胞核/胞浆呈现明确的黄色或棕黄色染色为阳性表达，细胞核蓝染的为苏木素复染的阴性细胞。在200倍镜下，用图像分析系统测量其吸光度值，每张切片随机检测5个视野，然后计算出平均吸光度值，以平均吸光度值作为P27表达水平的半定量参数。

2 结果

2.1 各组大鼠肾重、肾肥大指数的情况(表1)由表1可见，与SO组相比，M组、Q组、B组的肾重明显增加(t值分别为5.72、5.87、6.01，P＜0.01)，肾肥大指数亦明显增加(t值分别为13.60、10.14、9.31，P＜0.01)，提示模型制备成功；与M组相比，Q组、B组的肾重较轻，但差异不明显(t值分别为0.45、0.26，P＞0.05)，肾肥大指数明显减小(t值分别为3.16、2.56，P＜0.05)。

表1 各组大鼠肾重、肾肥大指数的比较 ±s)

表1 各组大鼠肾重、肾肥大指数的比较 ±s)

组 别 例数(只)肾重(g)肾肥大指数SO组 10 1.48±0.28 2.93±0.53 M组 10 2.58±0.54 9.69±1.48 Q组 10 2.48±0.46 7.67±1.38 B组 10 2.52±0.47 7.92±1.61

2.2 各组大鼠β2-微球蛋白和尿微量白蛋白情况(表2)由表2可见，与SO组相比，M组、Q组、B组的β2-MG水平升高(t值分别为13.41、10.05、9.33，P＜0.01)，UAlb水平亦明显升高(t值分别为6.90、2.50、2.62，P＜0.05);与M组相比，Q组、B组的β2-MG明显下降(t值分别为3.78、3.48，P＜0.01)，UAlb水平亦明显下降(t值分别为4.15、3.97，P＜0.01)。

表2 各组大鼠β2-MG、UAlb的比较 ±s)

表2 各组大鼠β2-MG、UAlb的比较 ±s)

组 别 例数(只)β2-MG(μg/24h)UAlb(μg/24h)SO组 10 115.38± 36.28 3.96±1.32 M组 10 756.25±146.68 9.82±2.34 Q组 10 526.53±124.20 5.82±1.95 B组 10 534.82±137.42 5.95±2.01

2.3 各组大鼠Scr、BUN的情况(表3)由表3可见，与SO组相比，M组、Q组、B组的Scr水平升高(t值分别为14.01、7.36、8.59，P＜0.01)，BUN水平亦明显升高(t值分别为8.62、7.14、8.52，P＜ 0.01)。与M组相比，Q组、B组的Scr水平下降(t值分别为4.91、4.71，P＜0.01)；与M组相比，Q组BUN水平下降明显(t=2.51，P＜0.05)，而B组BUN水平下降不明显(t=1.63，P＞0.05)。

表3 各组大鼠Scr、BUN的比较 (±s)

表3 各组大鼠Scr、BUN的比较 (±s)

组 别 例数(只)Scr(μ mol/L)BUN(mmol/L)SO组 10 28.80±3.45 7.41±1.32 M组 10 56.90±5.32 15.48±2.65 Q组 10 44.62±5.86 12.84±2.01 B组 10 45.80±5.22 13.78±1.96

2.4 各组大鼠肾脏组织形态学的情况 光镜下观察：SO组见肾小球结构清晰，未见增大及萎缩，球囊壁光滑，细胞外基质与系膜细胞分布正常，毛细血管腔清晰，系膜细胞无增生，基底膜无增厚。模型组肾小球面积增大，肾小球肿胀，肾小囊变窄，基底膜增厚，系膜增宽，系膜细胞增生，部分肾小管上皮细胞出现肥大、空泡变性，管腔变窄，部分小血管玻璃样变性。B组和Q组亦出现上述病理改变，但与模型组相比均有不同程度的减轻。

2.5 各组大鼠P27表达的比较(表4)由表4可见，与SO组相比，M组P27表达明显增加(t=7.71，P＜0.01)，Q组、B组P27表达增加不明显(t值分别为1.65、1.88，P＞0.05)；与M组相比，Q组、B组的P27表达明显下降(t值分别为3.59、3.63，P＜0.01)。

表4 各组大鼠P27表达的比较 ±s)

表4 各组大鼠P27表达的比较 ±s)

组别 例数(只)P27 S0组 10 2.72±0.48 M组 10 5.56±1.06 Q组 10 3.52±1.45 B组 10 3.58±1.36

3 讨论

DN是糖尿病最常见的严重微血管并发症，是糖尿病死亡的主要原因之一。大量的临床研究均证实血管紧张素转换酶抑制药可用于治疗DN，对糖尿病患者肾脏起到保护作用，可以延缓其肾功能的进一步恶化[5]。故本次研究以ACEI的代表药物——贝那普利作为对照，探讨槲皮素对DN的治疗作用及其机制，为其临床应用提供理论依据。

肾脏肥大是DN早期的特征性改变，也是预示后期肾功能减退的一个形态学指标。肾脏肥大主要是指肾脏体积增大，包括肾小球体积增大和肾小管细胞肥大，尤以后者为著，约占整个肾脏体积的90%。有研究发现[6]，高血糖、肾脏血流动力学的紊乱均可以刺激肾脏固有细胞，通过各种方式合成及释放相关细胞因子，影响肾脏固有细胞的增殖周期和细胞外基质(ECM)的合成，肾脏细胞肥大主要与周期素激酶抑制剂P27表达关系密切。

P27是一种分子量为27KD的热稳定蛋白，属于非特异性激酶抑制剂(CKI)家族一员，可抑制许多不同的Cyclins/CDK复合物的活性，使细胞不能通过G1期，G1期过度延长抑制细胞增殖，而对细胞周期进行调控。P27水平的高低对细胞是处于静止期或进入细胞周期具有重要的作用。在细胞增殖过程中，P27是细胞周期G1/S期转换过程的关键。研究发现，P27对肾脏细胞增殖、肥大、分化、凋亡等均具有重要的调控作用[7]，糖尿病高血糖状态刺激并上调P27表达，由于细胞中周期调节蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂P27表达的增加，可结合并灭活G1期时相相应细胞周期素与CDK复合物，导致CDK活性下降，阻止G1期向S期转变，细胞分裂停滞于G1期，表现为细胞蛋白质/DNA比值病理性增高、细胞肥大、ECM合成增多、基膜增厚，继而导致肾小球硬化、肾小管萎缩及间质纤维化等一系列不可逆病理改变。因此，调控P27功能可明显减轻糖尿病肾病的发生与发展。

本文结果显示，P27阳性细胞主要为胞浆呈棕褐色，假手术组P27阳性表达较少，模型组P27阳性表达明显增多，结合模型组高血糖、肾重大、肾脏肥大指数高，提示高糖刺激下P27表达增加，已知P27为CKD制性蛋白，可直接抑制多种CDK表达和活性，而P27的过强表达使细胞停顿于G1期，引起蛋白合成增加，从而致早期糖尿病肾病的细胞周期停顿及细胞肥大。因此，推断糖尿病肾病早期肾脏肥大至少部分与肾皮质P27蛋白表达增加有关，说明P27是一种十分重要的细胞周期负调节蛋白，与糖尿病肾病的发生、发展密切相关，在糖尿病肾病大鼠肾损害中起重要作用。与模型组相比，槲皮素组P27表达明显减少，结合肾重、肾脏肥大指数等指标，提示槲皮素可能通过抑制P27的表达，从而减弱对CKD活性的抑制，促使细胞越过S期而逆转细胞肥大。由此推断，通过下调P27表达，抑制肾脏细胞的过度增殖与肥大，进而减少ECM分泌，延缓DN的进展，从而发挥肾保护作用可能是槲皮素防治糖尿病肾病的机制之一。

[1]Wolf G，Schroeder R，Zahner G，et a1.High glucose induced hypertrophy of mesangial cells requires P27(kip1)，an inhibitor of cyclin-dependent kinases [J].Am J Pathol，2001，158(3):1091-1100.

[2]梅小斌，高从容，崔若兰，等.槲皮素降低肾小球周期素激酶抑制剂p27水平改善糖尿病肾病[J].上海医学，2003， 26(4):246-248.

[3]李列平，李雄，彭自全，等.槲皮素对大鼠慢性肾功能衰竭及促红细胞生成素水平的影响[J].中国医院药学杂志， 2004，24(7):412-414.

[4]Yokozawa T，Nakagawa T，Wakaki K，et al. Animal model of diabetic nephropathy[J].Exp Toxicol Pathol，2002，53(5):359-363.

[5]Zhang HJ,Xiao J,Chen ML,et al.Study of treating diabetic nephropathy with benazapril and valsartan[J]. Sichuan Journal of Physiological Sciences,2009,31(3):114-116.

[6]姜晓宇，袁伟杰.细胞周期调节蛋白与肾脏疾病[J].国外医学·遗传学分册，2003，26(2):67-69.

[7]Bischoff SC.Quercetin:potentials in the prevention and therapy of disease [J].Curr Opin Clin Nutr Metab Care，2008，11(6):733-740.