来源于干细胞的树突细胞激活免疫细胞对同源白血病干细胞的杀伤作用*

张丽莉 李世俊 司玉玲 梁芳芳 庞 华王玫

白血病是来源于血液系统的恶性肿瘤，是一组造血细胞大量分化受阻的恶性、克隆性、增生性疾病。60%~80%的患者经联合治疗后病情可缓解，但大多数患者终因复发而死亡。目前研究认为白血病干细胞（LSC）是白血病耐药复发的根源[1]，也是治疗的难点。针对LSC免疫治疗的研究较多，过继免疫治疗是免疫治疗的一个重要手段，该法通过直接向肿瘤患者体内输注具有抗肿瘤活性的免疫活性细胞，使其在体内发挥抗肿瘤作用。细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）和树突细胞（DC）联合的免疫治疗越来越受到临床关注，DC-CIK共同培养可明显提高CIK的增殖活性和细胞毒作用[2]。本实验通过观察DC-CIK共培养对自身LSC的杀伤作用，以探索白血病免疫治疗的新方法。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取中国医学科学院血液病研究所2010年9月—2011年9月收治的慢性粒细胞白血病加速期（CML-AP）患者10例，其中男6例，女4例，年龄35~78岁，中位年龄51岁，慢性期病程0.5~7.5年。所有患者诊断均符合参考文献[3]的诊断标准。经细胞形态学、细胞遗传学或细胞分子学检测确诊，荧光原位杂交（FISH）技术检测BCR/ABL融合基因阳性。

1.2 主要试剂与仪器 （1）试剂：RPMI-1640培养基（赛默飞世尔生物化学制品有限公司），新生胎牛血清、淋巴细胞分离液（天津血液研究所试剂公司），别藻青蛋白（APC）-CD34、藻红蛋白（PE）-CD38、异硫氰酸荧光素（FITC）-CD44、FITC-CD40、APC-HLA-DR、PE-CD80、叶 绿 素 蛋 白（Per⁃cp）-cy5.5-CD56、PE-cy7-CD83、PE-CD8、FITC-CD3、FITCP-GP（美国BD Bioscience公司），LDH释放实验试剂盒（美国Promega公司），重组人血小板生成素（rhTPO）、重组人干细胞生长因子（rhSCF）、重组人FMS样酪氨酸激酶3（FLT3）配体、重组人白细胞介素（rhIL）-3、重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、rhIL-4、重组人肿瘤坏死因子（rhTNF）-α、rhIL-2、重组人干扰素（rhIFN）-γ（英国Peprotech公司），抗人CD3单抗（武汉生物制品研究所）。BCR/ABL融合基因检测试剂盒（北京金菩嘉医疗科技有限公司）。（2）仪器：倒置显微镜（日本Olympus公司），超净工作台（江苏苏净集团安泰公司），流式分选仪、流式分析仪（美国BD公司），CO2孵箱（Ther⁃mo Forma公司）。

1.3 方法

1.3.1 LSC分离 无菌采集CML-AP患者骨髓3~5 mL，肝素抗凝，以淋巴细胞分离液密度梯度离心法获得1×108个骨髓单个核细胞（BMMC），使用常规 APC-CD34、PE-CD38、FITC-CD44抗体标记。用BD公司流式分选仪将标记好的BMMC以少量的标记细胞进行分选预实验，显示良好的分选效果后，进行大批量的分选。收集CD34+CD38-CD44+细胞。滴片观察细胞形态，并用苔盼兰检测细胞活率。

1.3.2 LSC扩增及DC的诱导 收集LSC，调整细胞浓度为（4~5）×104/mL，接种于24孔培养板，1 mL/孔。用完全培养基（含10%FCS的1640培养液），37℃饱和湿度、5%CO2孵箱中培养。用SFT因子组合（最终质量浓度rhSCF 100 μg/L、rh⁃FLT3 100 μg/L、rhTPO 100 μg/L、rhIL-3 10 μg/L）扩增2周，扩增至第6~7天第1次换液，补充等量完全培养基及全量细胞因子rhSCF、rhFLT3、rhTPO，3~4 d后第2次换液，调整细胞浓度为（4~5）×105/mL，补充全量上述细胞因子。扩增2周后诱导 DC，加入终浓度为 100 μg/L 的 rhGM-CSF、20 μg/L 的rhIL-4，在37℃饱和湿度、5%CO2孵箱中培养，每3~4 d换液1次调整细胞浓度（4~5）×105/mL，并补入全量的上述细胞因子，培养至6~8 d加入TNF-α 20 μg/L，3~4 d后收获。在整个培养过程中，每日观察细胞形态变化，培养结束时用流式细胞仪检测DC免疫表型。

1.3.3 CIK的培养及检测 取经CML-AP治疗后达到完全血液学缓解的患者骨髓，分离BMMC，在完全培养基中培养2 h，收集非黏附细胞，调整细胞数为3×106/mL，接种于24孔培养板中，1 mL/孔。当天即加入 50 μg/L 的 rhIFN-γ，刺激 24 h后，加入抗人CD3单抗50 μg/L及rhIL-2 30 μg/L，以后每3 d用含有30 μg/L rhIL-2的新鲜CIK培养液全量换液。培养到第7天，采用流式细胞仪检测细胞免疫表型，并将CIK与DC按10∶1比例混合培养。到共培养第7天收集细胞，用流式细胞仪检测细胞免疫表型，并调整细胞浓度为1×106/mL作为效应细胞。

1.3.4 细胞免疫表型及P-糖蛋白（P-gp）的检测 收集培养后的DC及共培养后的细胞，加入FITC-CD40、APC-HLA-DR、PE-CD80、PE-cy7-CD83；培养后CIK及共培养后的细胞加入Percp-cy5.5-CD56、PE-CD8、FITC-CD3；培养后的 DC 加入FITC-P-GP，用流式细胞仪检测细胞免疫表型及P-gp表达。

1.3.5 FISH法检测BCR/ABL融合基因 取分选后的白血病干细胞和培养后的DC，用新鲜配制的固定液（甲醛∶冰乙酸=3∶1）洗2遍后固定。20~30 cm高度滴于制备好的载玻片上，于2×SSC中浸泡15 min老化后，依次于75%、85%、100%乙醇中脱水1 min。自然干燥后在显微镜下画好细胞区域。在室温黑暗中，按照7∶2∶1比例将缓冲液、去离子水、探针加于EP管中配制探针混合物。按照10 μL/玻片，将探针混合物加于载玻片上已画好的细胞区域中，然后盖上盖玻片，用封片胶封片，置于湿盒中，42℃过夜。移去盖玻片，载玻片放入78℃，2×SSC/0.3NP-40洗液中，洗2 min，然后于室温2×SSC/0.1NP-40洗液中，洗1 min，烤箱干燥。DAPI复染剂10 μL加于杂交区域。干燥后，用Olympus显微镜选用合适的滤光片观察并分析。正常间期细胞信号特征为2个绿色和2个红色荧光信号；BCR/ABL融合基因如果为主要断裂点融合方式，单个间期细胞胞核中则显示1红1绿1黄1小红荧光信号，如果为次要断裂点融合方式，单个间期细胞核中则显示1红1绿2黄荧光信号。

1.3.6 乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测效应细胞对靶细胞的杀伤作用 将DC与CIK共同培养后的细胞作为效应细胞，调整细胞浓度为1×106/mL。同一患者BMMC分选后的CD34+CD38-CD44+细胞作为靶细胞，调细胞浓度为1×105/mL。LDH释放法分别测定各实验组在效靶比10∶1、20∶1、40∶1时的杀伤活性。每一效靶比下，设3个复孔，用酶标仪在490 nm波长下检测其吸光度（OD）值。按以下公式计算：

杀伤率（%）=（实验组OD值-效应细胞自然释放OD值-靶细胞自然释放OD值）（/靶细胞最大释放OD值-靶细胞自然释放OD值）×100%

1.4 统计学分析 采用SPSS 18.0软件，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，2组间均数的比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用Bonferroni-t法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DC增殖情况及P-gp表达 倒置显微镜下细胞形态一致，圆形，胞体较小。苔盼兰染色显示：细胞活率>95%。培养第5~7天，出现细胞体积增大，数量增多，2~8个细胞形成小细胞团，多形性细胞增多。诱导培养10 d左右，细胞聚集成团，胞体较大，易见细长的树枝状突起，细胞数量增加20~40倍。随着培养天数的增加，DC所占比例逐渐增大，培养前不足1%，培养结束时具有典型DC形态的细胞已达60%~80%，见图1。取培养后的DC检测P-gp表达，阳性率为（60.61±12.38）%。

Figure 1 DC with tipical morphology（A：×100，B：×400）图1 显微镜下具有典型形态的树突细胞（A：×100，B：×400）

2.2 培养前后DC免疫表型分析 CIK与DC共培养后，CD40、CD80、CD83及HLA-DR的构成均高于共培养前，差异有统计学意义（P<0.01），见表1。

Table 1 The analysis of DC’s immunophenotypes after co-cultured with CIK表1 DC共培养前后免疫表型分析（n=10，%±s）

Table 1 The analysis of DC’s immunophenotypes after co-cultured with CIK表1 DC共培养前后免疫表型分析（n=10，%±s）

**P<0.01

时间DC共培养前DC共培养后t CD40 41.28±10.76 77.79±11.98 7.171**CD80 46.35±13.10 81.50±9.45 6.877**CD83 32.41±4.30 82.76±6.20 10.185**HLA-DR 50.28±9.93 70.48±11.01 8.775**

2.3 BCR/ABL融合基因检测 取4例CML患者分选后白血病干细胞检测BCR/ABL融合基因重排，LSC的BCR/ABL融合基因表达阳性，阳性率为（80.84±17.18）%，见图2A；诱导结束后DC的BCR/ABL融合基因表达阳性，阳性率为（48.42±20.69）%，见图2B；差异无统计学意义（t=2.411，P>0.05）。

2.4 共培养前后CIK免疫表型分析 CIK与DC共培养后，CD3、CD3CD8、CD3CD56的成熟表型表达率高于共培养前，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.5 不同效靶比时效应细胞对靶细胞的杀伤作用 3种效靶比对应的杀伤率差异有统计学意义（P<0.01），随着效靶比的增加，细胞杀伤作用增强，各效靶比间差异有统计学意义（P<0.01），见表3。

Figure 2 The expression of bcr/abl fusion gene图2 BCR/ABL融合基因表达图

Table 2 The analysis of CIK's immunophenotypes after co-cultured with DC表2 CIK共培养前后免疫表型分析（n=10，%，x ±s）

Table 3 The comparison of killing effects in different effector-target ratio表3 不同效靶比时杀伤率比较 （n=10，%±s）

Table 3 The comparison of killing effects in different effector-target ratio表3 不同效靶比时杀伤率比较 （n=10，%±s）

**P<0.01

10∶1（1）20∶1（2）40∶1（3）F 11.15±3.94 31.13±12.01 59.13±12.82 53.77**组比（1）∶（2）（2）∶（3）（1）∶（3）t 4.30**6.02**10.32**统计学处理效靶比 杀伤率

3 讨论

LSC位于细胞克隆的起始阶段，对白血病的发生、发展起着关键性作用，是白血病耐药复发的根源。以ABC转运蛋白为治疗靶点是目前研究的热点，针对ABC转运蛋白的治疗主要集中在抑制其功能方面，并取得可喜的进展，但在临床研究过程中，因其巨大不良反应、非特异性杀伤正常生理ABC转运蛋白以及定位肿瘤细胞表面功能差等多种原因限制了此项研究的发展，而siRNA、基因治疗及ABC转运蛋白抗体的临床研究面临同样困难，故以ABC转运蛋白为靶点的生物免疫治疗被大多数研究者看好。近年来联合DC和CIK免疫治疗LSC的研究逐渐受到关注，其能较彻底的清除残余肿瘤细胞，被认为是具有较大潜力的治疗措施。

CIK 是在白细胞介素（IL）-2、IL-1、干扰素（IFN）-γ和Anti-CD3单抗等作用下，由外周血、骨髓或脐血中分离出的单个核细胞培养而获得的一种具有细胞毒作用的免疫活性细胞。目前公认的其抗肿瘤细胞的主要机制是非主要组织相容性复合体（MHC）限制性杀伤肿瘤细胞，它在体内体外均具有较高抗肿瘤活性，可以通过分泌细胞质颗粒，分泌穿孔蛋白（PFP），产生大量炎性细胞因子（如IFN-γ、TNF-α、IL-2等），通过配体受体（Fas∶Fc）介导等多种杀瘤机制杀伤肿瘤细胞。Linn等[4]研究表明，白血病患者的自体CIK细胞具有杀伤自体及异体白血病细胞的作用。DC是已知的体内功能最强的抗原递呈细胞，是激发特异性免疫应答的中心和抗肿瘤免疫的重要载体，其不仅可以提呈抗原激发T细胞特异性免疫应答，还可以促进非特异性的细胞毒杀伤，以DC为基础的免疫治疗已经成为癌症治疗最有希望的办法之一。杨栋林等[5]成功地从CML患者骨髓CD34+细胞中扩增诱导出大量DC。Eisendle等[6]研究发现CML造血干细胞在一定细胞因子作用下能够沿着DC的发育途径正常分化为DC。有报道证实造血干细胞能成功诱导为DC，不受白血病患者的疾病分期、治疗情况等的影响，其产率和正常人相同[7]。

P-gp是由mdr1基因编码的一种糖蛋白，在血液肿瘤中，mdr1 mRNA以及其产物P-gp的高度表达已被证实为最重要的多药耐药机制。Jonker等[8]研究认为P-gp的高表达是肿瘤干细胞的重要特征。慢性粒细胞白血病特征性的细胞遗传学变化是pH染色体阳性，BCR/ABL融合基因是CML发病的分子基础，因此本研究选择P-gp及BCR/ABL融合基因作为CML白血病干细胞的标志进行分析，结果显示DC高表达P-gp，BCR/ABL融合基因阳性，DC具有典型的干细胞标志，且CML特征性的遗传学标志表达阳性，因此其具备CML白血病干细胞的特征。

本课题组以往研究发现，与DC共培养后，CIK细胞数目增多，增殖速率加快，成熟表型表达率增高，杀伤肿瘤能力增强[9]。本实验将CML干细胞DC与CIK共同培养，用流式细胞方法检测共培养前后的DC和CIK细胞免疫表型，发现DC与CIK共同培养后，表达成熟免疫表型，且表达率比共培养前增高，提示DC、CIK培养成熟，且共同培养可提高DC、CIK成熟度，与以往实验结果一致[9]。通过检测效应细胞对靶细胞杀伤效应，结果显示效应细胞对靶细胞有杀伤作用，且随着效靶比的增加杀伤活性增强，提示LSC来源的DC与CIK共培养对自身LSC有杀伤作用。其机制可能为：（1）DC高表达MHC-Ⅱ类分子（HLA-DR）和CD80/CD86等共刺激分子，为CIR活化提供信号刺激，激活的CIK通过免疫球蛋白Fc受体使淋巴细胞功能相关抗原-1（LFA-1）和细胞间黏附分子-1（ICAM-1）的亲和力增高，并向细胞间排出含有BLT的胞浆毒性颗粒，引发胞浆毒性颗粒依赖性溶细胞作用。（2）DC分泌高水平IL-2、IL-12、IFN-γ等多种细胞因子，可以诱导CIR生成，促进CIK的活化和增殖，间接启动CIK[10]，并提高CIK分泌白细胞介素-4（IL-4）、干扰素γ（IFN-γ）等细胞因子的能力，增强体内外抗肿瘤活性[11]。但具体机制尚待进一步研究。

[1]Lapidot T,Sirard C,Vormoor J,et al.A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice[J].Nature,1994,367(6464):645-648.

[2]李鹏新,李贵新,路中,等.脐血DC与CIK共培养对白血病K562细胞杀伤活性的影响[J].山东医药,2010,50（13）:39-40.

[3]张之南,沈悌.血液病诊断与疗效标准[M].北京:科学出版社,2007:134-139.

[4]Linn YC,Lau LC,Hui KM.Generat ion of cytokineinduced kil ler cells from leukaemic samples with in vitro cytotoxicity against autol⁃ogous and allogeneic leukaemic blasts[J].Br J Haemat ol,2002,116(1):78-86.

[5]杨栋林,刘庆国,阎嶂松,等.两步法从慢性髓系白血病患者骨髓CD34+细胞体外扩增诱导树突状细胞[J].生物医学工程与临床,2007,11(3):218-223.

[6]Eisendle K,Wolf D,Gastl G,et al.Dendritic cells from patients with chronic myeloid leukemia:functional and phenotypic features[J].Leuk Lymphoma,2005,46(5):663-670.

[7]Eisendle K,Lang A,Eibl B,et al.Phenotypic and functional defi⁃ciencies of leukaemic dendritic cells from patients with chronicmy⁃eloidleukaemia[J].Br J Haematol,2003,120(1):63-73.

[8]Jonker JW,Buitelaar M,Wagenaar E,et al.The breast cancer resis⁃tance protein protects against a major chlorophyll-derived dietary phototoxin and protoporphyria[J].Acad Sci USA，2002,99(24):15649-15654.

[9]庞华,司玉玲,綦振家,等.耐药乳腺癌裸鼠模型免疫治疗初探[J].天津医药，2011,39(12):1136-1140.

[10]Curti A,Pandolfi S,Aluigi M,et al.Interleukin-12 production by leukemia-derived dendritic cells counteracts the inhibitory effect of leukemic microenvironment on T cells[J].Exp Hematol,2005,33(12):1521-1530.

[11]Gonzalez-carmona MA,Marten A,Hoffmann P,et al.Patient-de⁃rived dendritic cells transduced with an a-fetoprotein-encoding ad⁃enovirus and co-cultured with autologous cytokine-induced lym⁃phoncytes induce a specific and strong immune response against he⁃patocellular carcinoma cells[J].Liver Int，2006,26(3):369-379.