小鼠磨牙牙胚发育过程中Versican之多糖链的时空变化

蒋备战，王佐林

(1.同济大学口腔医学院牙体牙髓病学教研室，上海 200072;2.同济大学口腔医学院口腔颌面外科教研室，上海 200072)

Versican是细胞外基质中大分子硫酸软骨素蛋白聚糖家族的重要成员。研究表明，它是由一个核心蛋白和连接在其上的12～15条硫酸软骨素多糖链构成，其硫酸软骨素多糖链有4-硫酸软骨素(C4S)和 6-硫酸软骨素(C6S)两类。Versican的硫酸软骨素多糖侧链在不同的组织表达各异，甚至在机体发育的不同阶段也会发生改变［1］。

此前的研究表明，Versican的核心蛋白在小鼠牙齿发育过程中呈特异性的时空表达模式，在牙胚的形态发生、细胞增殖与分化等方面起重要作用［2-4］，但有关其硫酸软骨素多糖侧链在牙胚发育过程中的时空变化尚不清楚，因此本次实验采用免疫组织化学方法，同时检测Versican的核心蛋白及其硫酸软骨素多糖链在小鼠磨牙牙胚发育过程中的时空变化，为更全面地了解Versican在牙胚发育过程中的的作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料

实验所用ICR孕鼠由上海生命科学院动物实验中心提供。兔抗鼠多克隆Versican抗体由东京医科齿科大学大学院Tamayuki Shinomura教授惠赠，2B6(识别4-硫酸软骨素)，3B3(识别6-硫酸软骨素)购自Seikagaku公司(日本东京)。SABC免疫组化试剂盒购自美国DAKO公司，AEC显色试剂盒购自日本Nichirei公司，采用日本Olympus光学显微镜和数码图像采集系统采集图片。

1.2 切片制备

以出现阴道栓当日清晨定为胚胎发育的0 d(Embryonic Day 0，E 0 d)。分别取 E 11.5 d、E 12.0 d、E 13.5 d、E 15.0 d、E 16.5 d、E 18.5 d 的ICR孕鼠各三只，乙醚麻醉后断颈处死并取胎鼠头部，PBS清洗干净后用新鲜配制的4%多聚甲醛(pH 7.4)固定24 h，系列乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，矢状或冠状切片，制成5 μm厚的组织切片，4℃下保存备用。

1.3 免疫组织化学实验

选择制备好的石蜡切片，用SABC法进行免疫组化实验，即常规脱蜡至水，用酶消化法修复抗原，其中Versican用透明质酸酶(25 mg/ml)37℃下消化1 h;2B6，3B3用硫酸软骨素酶ABC(1 mU/μl)37℃下消化3 h，0.01 M PBS液漂洗后用1%H2O2封闭内源性过氧化物酶活性。再经PBS液漂洗，用1%牛血清白蛋白PBS缓冲液去除非特异性染色后滴加一抗，室温孵育1 h，PBS漂洗后滴加二抗，室温孵育15 min后PBS漂洗，AEC显色，苏木精复染，甘油封片，镜检拍照。

2 结 果

实验结果显示，自小鼠磨牙牙胚开始发生(E 11.5 d)至成牙本质细胞和成釉细胞开始分化(E 18.5 d)的过程中，Versican之多糖链在牙源性上皮组织与牙源性间充质组织中的表达随着牙胚发育的进程而发生动态变化。

在E 11.5 d，小鼠下颌第一磨牙牙胚开始发育，表现为口腔上皮的局部增生，形成牙板，此时未能检测到Versican核心蛋白(图1A)，而4-硫酸软骨素多糖链(C4S)在增厚的牙源性上皮以及基底膜所在区域强表达，但与基底膜紧邻的牙源性间充质组织中却未能检测到(图1B)，而6-硫酸软骨素多糖链(C6S)在牙源性上皮组织以及基底膜所在区域均未能检测到，在深层的牙源性间充质细胞表达也不明显(图1C)。

在E 12.0 d，小鼠下颌第一磨牙牙胚继续发育，进入蕾状早期，在增生的牙板上皮以及基底膜区域Versican核心蛋白表达明显，C4S的免疫染色与核心蛋白一致，而C6S在增生的上皮中无表达(图2A，B，C)。

在E 13.5 d，小鼠下颌第一磨牙牙胚发育进入蕾状晚期，Versican核心蛋白在牙蕾中央的上皮细胞外基质中表达明显，于其紧邻的间充质细胞间也开始有表达，C4S的表达与其基本一致，而C6S在牙蕾上皮中的免疫染色为阴性，在其深层的牙源性间充质细胞区域开始表达(图3A，B，C)。

在E 15.0 d，小鼠下颌第一磨牙牙胚处于帽状期，Versican核心蛋白在成釉器的星网状层、牙乳头、牙囊细胞间强表达，而在内外釉上皮细胞间无表达。C4S在此时的表达与核心蛋白不完全一致，除在星网状层细胞间有强表达外，开始在紧邻基底膜处折叠的牙乳头细胞弱表达。而C6S在牙乳头以及牙囊细胞间的表达与Versican的核心蛋白表达基本一致(图4A，B，C)。

在E 16.5 d，小鼠下颌第一磨牙处于钟状早期，Versican核心蛋白及硫酸软骨素多糖链的免疫组化检测结果与E 15.0 d大致相同，但在未来牙尖形成区的牙乳头间充质细胞区域C4S有明显表达。C6S的表达仍然局限于牙乳头间充质细胞与牙囊细胞，但其在C4S表达的间充质细胞所在区域消失，C4S与C6S在牙乳头组织中呈现互补的表达模式(图5A，B，C)。

在E 18.5 d，小鼠下颌第一磨牙处于钟状晚期，Versican核心蛋白在成釉器中的表达与此前一致，而其在牙乳头细胞的表达与此前的表达却有不同，其在分化的成牙本质细胞所在区域以及前期牙本质中不表达，但在颈环周边的表达却很明显。C4S的表达也发生改变，其在成釉器中的表达局限于星网状层，在已经分化成熟的成釉细胞、成牙本质细胞所在区域不表达，而在前期成牙本质细胞以及颈环内侧未分化的牙乳头间充质细胞表达明显，在前期牙本质所在区域表达较弱。C6S的表达在牙尖形成区域逐渐消失，在深层以及颈环内侧的牙乳头间充质细胞所在区域仍有表达，C4S与C6S的互补性表达也更加明显(图6A，B，C)。

3 讨 论

牙齿作为机体的一个器官与其他器官的生长发育一样是一个复杂的过程，细胞外基质在这一过程中起着重要作用［5-6］。近30年来，Versican作为细胞外基质中大分子硫酸软骨素蛋白聚糖在疾病发生与器官发育中的作用越来越受到关注［7］。Versican之硫酸软骨素糖链可以与透明质酸、CD44等相连接，在支持细胞，构建细胞生存微环境发挥重要作用［8-9］。

研究证明Versican基因及蛋白在小鼠磨牙牙胚发育过程中呈特异性的时空表达，但有关其多糖侧链的时空变化尚不清晰，为此本实验分别采用了识别其核心蛋白与硫酸软骨素多糖链的抗体，用免疫组织化学的方法系统检测了小鼠下颌第一磨牙牙胚发育过程中的Versican核心蛋白及其硫酸软骨素多糖链的表达。结果表明Versican核心蛋白与其硫酸软骨素多糖链的表达在牙胚的不同发育阶段以及牙胚的不同组织结构中呈特异性时空表达。Versican在成釉器发育过程中其多糖链为C4S，C6S从未在牙源性上皮组织中表达;而在牙乳头中Versican之多糖链在牙胚开始发育时以C6S为主，随后在未来牙尖形成区域及其紧邻的牙乳头间充质细胞逐渐消失，取而代之的是C4S，且C4S与C6S在牙乳头组织中呈特异性互补表达模式。

Versican核心蛋白在E 11.5 d的牙源性上皮与深层间充质中均不表达，但可以清楚的检测到C4S的强表达，而自E 12.0 d起Versican之核心蛋白与C4S在增生的牙蕾上皮组织中表达，并在随后各期的成釉器星网状层中均可检测到，这种情况持续到E 18.5 d，结果与 Tsuyoshi Hikake［10］等报道部分相同。这提示Versican的多糖侧链可能早于核心蛋白的表达，C4S在牙冠的形态发生中可能起着重要作用。

Versican在牙源性间充质及其衍生组织中的检测结果表明，其核心蛋白自E 12.0 d开始在牙源性间充质中表达，在随后的 E 15.0 d，E 16.5 d，其在牙乳头细胞聚集区强表达。此时Versican之多糖链以C6S为主，很少有C4S在牙乳头间充质的表达，而从E18.5 d起C4S在未来牙尖形成区域强表达，而C6S在相应区域则消失，这提示C4S和C6S的特异性互补表达可能与牙尖的发育过程中的成釉细胞、成牙本质细胞的分化以及牙本质基质的形成密切相关。

综上所述，Versican之硫酸软骨素多糖链在牙胚不同发育阶段以及不同组织中的硫酸化模式不同，C4S与C6S在牙齿发育过程中表现为很强的互补性，这种动态的互补性改变可能与牙胚形态发生、细胞增殖与分化密切相关，具体机理有待进一步研究。

［1］Wight TN.Versican:a versatile extracellular matrix proteoglycan in cell biology［J］.Curr Opin Cell Biol，2002，14(5):617 －623.

［2］Beizhan J，Tamaki Yokohama-Tamaki，Zuo-lin Wang，et al.Expression，localization and synthesis of versican by the enamel organ of developing mouse molar tooth germ:anin vivoandin vitrostudy［J］.Archive of Oral Biology，2010，55(12):995 －1006.

［3］蒋备战，柴田俊一，王佐林.Versican在ICR胎鼠下颌第一磨牙牙胚发育过程中的表达［J］.实用口腔医学杂志，2009，25(5):625 －629.

［4］蒋备战，柴田俊一，王佐林.Versican基因在牙根发育过程中的作用［J］.口腔颌面外科学杂志.2010，20(2):91－94.

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