COPD患者TH17细胞的表达及糖皮质激素的调节作用

彭 清，温雪萍，颜志军，高习文

(上海市闵行区中心医院呼吸内科，上海 201199)

慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是呼吸系统常见的疾病，在吸烟等环境因素的作用下，其发病率在全球范围内不断增加。和支气管哮喘一样，COPD也是一个气道炎症性疾病，中性粒细胞的募集和活化是COPD发病中的一个关键环节。TH17细胞是新发现的除TH1细胞和TH2细胞之外的 CD4+T细胞［1-2］，其分泌的IL-17具有强大的招募中性粒细胞的功能［3-6］。THl7细胞在COPD的发病中扮演重要角色［7］。因此，进一步探讨TH17细胞在COPD中的具体作用及其机制显得尤为迫切。近年来，糖皮质激素在COPD尤其是重度、极重度COPD中的应用越来越受到重视。糖皮质激素能降低IL-17、IL-6和TNF-α等细胞因子的表达［8-9］，那么糖皮质激素是否也通过对TH17的调节达到抑制COPD慢性炎症过程，目前尚无报道。本课题通过比较健康人群、COPD稳定期患者TH17细胞构成和细胞因子分泌情况，探讨TH17细胞在COPD中的作用;通过应用糖皮质激素对COPD患者进行干预，探讨糖皮质激素是否通过对TH17的调节达到抑制COPD慢性炎症过程。本研究有助于明确COPD的发病机制，对于今后COPD患者的治疗提供了新的思路。

1 材料与方法

1.1 试剂

PE-CY5抗人CD4单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)购自BD pharmingen公司。PE抗人IL-17mAb及同型对照均购自ebioscience公司。佛波酯(Phorbol 12-myristate-13-acetate，PMA)、离子霉素(Ionomycin)、莫能菌素(Monensin)、植物血凝素P(Phytohenmagglutinin-P，PHA)及皂素购自美国Sigma公司。人淋巴细胞分离液购自上海博蕴生物科技有限公司。RPMI1640培养液、胎牛血清购自Gibco公司。人细胞因子IL-17、IL-4及IFN-γ的酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒购自R＆D公司。

1.2 研究对象

根据慢性阻塞性肺疾病诊治指南的诊断标准，吸入支气管舒张剂后第1秒用力呼气容积(forced expiratory volume in one second，FEV1)/用力肺活量(forced vital capacity，FVC)＜70%，FEV1占预计值＜50%，选取1个月内未应用全身激素的COPD稳定期患者共38例，所有患者给予规律吸入布地奈德800 μg/d，研究持续3个月，3个月后为治疗组。研究期间若出现症状，可按需使用短效支气管扩张剂，其中8例出现COPD急性加重，予以剔除，剩余30例为COPD稳定期组，其中男性22例，女性8例，平均年龄(58.53±6.94)岁。我院门诊不吸烟的健康体检者30例为正常对照组，其中男性20例，女性10 例，平均年龄(55.30 ±6.99)岁，两周内无急性感染，无长期用药史，肺功能正常。本实验通过伦理委员会批准，入选患者均签署知情同意书。

1.3 流式细胞术检测外周血TH17细胞的表达

抽取入选研究对象的外周静脉血3 ml(肝素抗凝)，Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，调整PBMC密度至2×106ml。悬浮于RPMIl640培养液(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和0.1 ng/ml链霉素)。取PBMC悬液(2×106ml－1)加入24孔培养板内，每孔1 ml，加入PMA(20 ng/ml)、离子霉素(1 μg/ml)和莫能菌素(2 nmol/ml)，置培养箱中培养4 h(37℃，5%CO2)。收集细胞后分为同型对照管和实验管，加入PE-CY5抗人CD4 mAb 10 μl避光室温孵育30 min。洗涤弃上清，予4%多聚甲醛固定，室温放置 20 min。予 0.1%皂素穿膜10 min，离心弃上清，每管约留200 μl穿膜液重悬细胞。实验管加入PE抗人 IL-17 mAb 10 μl，同型对照管加入同型对照抗体，室温避光孵育1 h。洗涤后重悬细胞于300 μl洗涤液，上流式细胞仪检测。以CD4直方图设门区分出CD4+细胞，以散点图表示IL-17+细胞，用CellQuest软件获取并分析数据。

1.4 ELISA 检测 IL-17、IL-4、IFN-γ 水平

抽取入选研究对象的外周静脉血5 ml(肝素抗凝)。全血离心后收集血浆－80℃冻存待ELISA检测。取上述冻存的血浆，通过ELISA双抗体夹心法检测细胞因子 IL-17、IL-4、IFN-γ，具体操作按照试剂盒提供的说明书进行。

1.5 统计学处理

所有数据资料均以±s表示。所有数据结果采用SPSS12.0统计软件包进行分析，统计分析采用方差分析及q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 外周血TH17细胞比例

通过流式细胞术对细胞表面标志及细胞因子的检测显示，外周血中CD4+IL-17+细胞(TH17细胞)比例在三组之间有显著差异(P＜0.05)，COPD稳定期组TH17细胞在外周血CD4+阳性细胞中所占的比例(3.13±0.91)%，要高于治疗组(2.30±1.95)%和正常对照组(1.21 ±0.40)%，治疗组外周血中TH17细胞比例也显著高于正常对照组(P＜0.01)。

2.2 血浆中 IL-17、IL-4、IFN-γ 水平

ELISA检测表明，血浆中 IL-17和 IFN-γ水平在三组之间有显著差异(P＜0.01)，其中COPD稳定期组要高于治疗组和正常对照组，而治疗组也均高于正常对照组。血浆中IL-4水平在三组之间差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表 1 血浆 IL-17、IL-4、IFN-γ水平Tab.1 Comparison of levels of plasma IL-17，IL-4 and IFN-γ in three groups(pg/ml)

3 讨 论

COPD是世界范围内危害人类健康的疾病，发病率和死亡率都很高，其确切发病机制仍不十分清楚，反复发生的气道慢性炎症在COPD的发生发展中起了重要作用，中性粒细胞、CD8+T淋巴细胞、巨噬细胞是COPD异常炎症反应的三种关键细胞，有多种细胞因子、趋化介质、蛋白酶和氧化应激等参与COPD炎症的发生。中性粒细胞的募集和活化是COPD发病中的一个关键环节。研究提示:COPD患者支气管肺泡灌洗液及诱导痰中中性粒细胞明显增加，甚至在已戒烟患者发现了同样的炎症过程，表明炎症发生后即在气道内持续存在，且肺功能测量值第1秒用力呼气容积(FEV1)与气道中性粒细胞的数量呈负相关［10］。COPD患者严重程度越重往往中性粒细胞数量越高，气道炎症越显著。中性粒细胞在呼吸道大量渗出是COPD炎症反应的特征，但中性粒细胞活化和聚集的机制尚未完全清楚，目前认为与巨噬细胞、T淋巴细胞及上皮细胞等所释放炎性趋化因子的作用和粘附机制相关。

TH17细胞是新发现的除TH1细胞和TH2细胞之外的CD4+T细胞，分泌IL-17、IL-6和TNF-α，从而发挥其生物学效应［11］。THl7细胞分泌的IL-17能在组织局部诱导产生多种细胞因子、生长因子和趋化因子，促进中性粒细胞向病灶部位迁移［3-4，12］。IL-17敲除小鼠不能招募中性粒细胞至感染部位，从而使迟发型超敏反应、接触性过敏反应下降。中性粒细胞是COPD异常炎症反应的关键细胞，THl7细胞分泌的IL-17具有强大的招募中性粒细胞的功能，那么THl7细胞在COPD的发病中是否扮演重要角色，认为细菌、病毒、一些非典型病原体及大气污染等均可导致COPD急性加重，而这些因素可能影响了TH17细胞的表达，因此本课题仅选取COPD稳定期患者作为研究对象。通过流式细胞术对细胞表面标志及细胞因子的检测显示，COPD稳定期组外周血中TH17细胞表达要显著高于正常对照组，同样ELISA检测表明，COPD稳定期组血浆中IL-17的表达水平高于正常对照组，差异有统计学意义。因此，结合目前国内外的研究我们认为，TH17细胞可能通过其释放的IL-17诱导成纤维细胞释放IL-6、IL-8、前列腺素E、粒细胞集落刺激因子等，刺激巨噬细胞产生IL-1β、TNF-α，促进中性粒细胞趋化与激活，从而参与COPD的气道炎症［13-15］。近年来，有学者提出了COPD是自身免疫性疾病的假设［16-20］。已有一些证据显示，TH17细胞是自身免疫性疾病的重要致病因素［21］，其分泌的IL-17可能通过诱导和维持炎症，参与适应性免疫在COPD 的发生、发展中起作用［22］。

以往的研究认为激素在哮喘中有效，是因为可以抑制哮喘气道中的嗜酸性粒细胞炎症，COPD稳定期没有嗜酸性粒细胞，主要为嗜中性粒细胞，而中性粒细胞炎症对激素抵抗，故不主张将激素应用于COPD［23-24］。糖皮质激素在COPD尤其是重度、极重度COPD中的应用越来越受到重视。Gartlehner等［25］对ICS治疗COPD的临床研究资料做了荟萃分析，结果表明与安慰剂相比，长期应用ICS虽然不影响COPD的死亡率，但可显著减少急性加重的次数。2008年GOLD推荐ICS适用于有呼吸道症状，第1秒用力呼气容积占预计值的百分比(FEV1%)＜50%，而且有反复急性加重的COPD患者。那么糖皮质激素究竟通过什么途径发挥其生物学效应。TH17的发现可能为此提供了启示。Prause等［8］研究发现，糖皮质激素能显著降低内毒素诱导的小鼠肺组织、支气管灌洗液中IL-17的表达，从而抑制了中性粒细胞的聚集，发挥其抗炎作用。还有研究报道在H5N1病毒诱发小鼠ARDS的模型中，糖皮质激素能够显著降低支气管灌洗液中IL-6和TNF-α的表达［9］。本研究表明COPD稳定期组TH17细胞和血浆中IL-17的表达要显著高于正常对照组，给予吸入糖皮质激素治疗后，TH17细胞和血浆中IL-17的表达较前明显降低，仍高于正常对照组。糖皮质激素可能通过对TH17细胞的抑制，降低了其分泌的细胞因子水平，减少了其炎性效应，从而缓解了临床症状，改善生活质量。

综上所述，TH17细胞可能通过其释放的IL-17，促进中性粒细胞趋化与激活，从而在COPD的发生、发展各个环节中起着重要作用，而糖皮质激素可能通过对TH17的调节达到抑制COPD慢性炎症过程。TH17细胞表达水平的增加是否可作为一种判断COPD及其预后的独立指标，以及以TH17细胞中心的靶像治疗在COPD中的可行性与有效性尚需大样本多因素的临床实验研究来支持。进一步研究TH17细胞在COPD中的作用和各种具体机制，尤其是基因调控机制，不仅对更深入了解COPD的发病机制，而且对COPD患者的预后评估以及临床治疗都有着非常重要的意义。

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