LDL对小鼠成骨细胞的影响

倪菊花，翟玉娟，周 筠，雷 涛

(同济大学附属同济医院内分泌科，上海 200065)

骨质疏松症(Osteoporosis，OP)是一种以单位体积内骨量降低，骨组织微结构退化，骨皮质变薄，骨小梁数目减少，骨髓腔增宽，骨强度减低为特征，导致骨质脆性增加易于发生骨折的全身性疾病。随着我国人口的老龄化，骨质疏松症正在成为一种新型的流行病，由骨质疏松症引起的骨折及其他并发症严重影响患者生活质量，给国家和社会造成了极大的经济负担。因此，如何有效预防和治疗骨质疏松症成为了近年来研究的一大热点。众多研究表明，血脂紊乱和骨质疏松之间关系密切［1-4］，但结论不一，仍存在着很大的争议，且其之间相互关联的确切机制也尚不明确。本课题拟检测低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDL)对于MC3T3-E1成骨细胞增殖、分化能力的影响，并利用实时荧光定量技术检测LDL作用下的LRP5、DKK1基因mRNA表达情况，以分析其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验细胞

成骨细胞株MC3T3-E1购于中国科学院细胞库，于同济医院保种。

1.2 主要实验材料、试剂和仪器

LDL购于广州奕源生物科技有限公司，小鼠骨钙素ELISA Kit购于美国IBL公司，细胞培养瓶、培养板购自美国Corning公司，高糖a-MEM培养基及胎牛血清均购自美国 Gibco公司，TRIzol购于Invitrogen公 司，PrimeScriptTM RT reagentKit(Perfect Real Time)DRR037A购于Takara公司，SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)DRR041A购于Takara公司，引物由上海生工生物有限公司合成。酶标仪(METERTECH Σ960)，培养箱(Thermo HEPA class100)，荧光定量 PCR仪(Roche Cycler application system Version 1.5)。

1.3 LDL对小鼠成骨细胞增殖影响

取对数生长期的MC3T3-E1细胞，配细胞悬液密度为2×104/ml后，在96孔板选择20孔，分别在24、48、72 h三个时间组。每个时间组里分 0.05、0.10、0.20 mg/ml LDL 和空白对照组。每孔注入100 μl细胞悬液，对于实验组每孔细胞，轻轻注入相应量LDL和一定量的无血清的a-MEM培养液，使实验总体系为150 μl，使LDL混合液浓度分别达到0.05、0.10、0.20 mg/ml。对照组均加入 100 μl的细胞悬液，每孔再加入50 μl的无血清a-MEM 培养液，每一浓度做5个复孔。按24、48、72 h三个细胞培养时间段进行如下操作:每孔加入10 μl的CCK8溶剂，继续培养2 h。在酶联免疫检测仪上检测450 nm波长处各孔的吸光度(OD)值。

1.4 细胞培养液中骨钙素水平的测定

细胞传代后培养于直径为6 cm的细胞培养皿，约70%融合时同上分别加入相应量的LDL和一定量的无血清的a-MEM培养液，使实验总体系为2 ml，使 LDL 混合液浓度分别达到 0.05、0.10、0.20 mg/ml。并设对照组。继续培养24、48和72 h收集细胞培养上清，用OC测定试剂盒(EL ISA法)检测给药组、对照组细胞上清OC水平。建立标准曲线:设标准孔8孔，每孔中各加入样品稀释液100 μl，第一孔加标准品 100 μl，混匀后用加样器吸出100 μl，移至第二孔，如此反复作倍比稀释至第七孔，最后，从第七孔中吸出100 μl弃去，使之体积均为100 μl，第八孔为空白对照。参照美国IBL公司小鼠骨钙素ELISA Kit说明书完成ELISA，在450 nm处测吸光值。结果计算与判断:所有OD值都应减除空白值后再行计算。以标准品1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、0 ng/ml之 OD 值在半对数纸上作图，画出标准曲线。根据样品OD值在该曲线图上查出相应小鼠Osteocalcin含量。

1.5 小鼠成骨细胞中LRP5、DKK1mRNA的表达

分别以 0.05、0.10、0.20 mg/ml浓度的 LDL 作用于成骨细胞MC3T3-E1 24、48和72 h。荧光定量PCR检测DKK1和LRP5 mRNA的表达，分别收集细胞，Trizol法提取总RNA，根据Takara RT-PCR试剂盒说明书，进行cDNA合成和PCR扩增。引物根据Medline基因文库用 Primer 5.0软件自行设计(表1)。反应结束后，RQ manager分析软件统计处理，获取Ct值，并根据熔解曲线判断产物的纯度。

表1 各基因和内参引物Tab.1 Genes and Internal control primers

1.6 统计学方法

所有实验均重复检测三次，去除异常值后取平均值，计量资料采用均数±标准差的形式表示。采用SPSS13.0统计软件行单因素方差分析统计CCK8和ELISA实验组及对照组之间的差异。实时荧光定量检测，结果分析根据Kenneth［5］的描述，采用半定量分析。样品数据符合正态分布，本实验用单因素方差分析检测LRP5、DKK1 mRNA在实验组和对照组之间的差异，P＜0.05认为有统计学意义。

2 结 果

2.1 LDL对小鼠成骨细胞增殖影响

实验结果表明，在24 h LDL浓度为0.05 mg/ml时，成骨细胞的增殖受到明显抑制，与对照组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。LDL作用时间为48 h，浓度为0.20 mg/ml时，对该株细胞增殖的抑制作用最大，为63.48%。单因素方差分析显示同一时间点，0.05、0.10、0.20 mg/ml HDL 和 LDL 浓度组和对照组OD值差异显著(P＜0.01);同一浓度，24、48、72 h不同作用时间 OD值差异显著(P＜0.01)，提示LDL对成骨细胞增殖的作用在一定程度上呈剂量及作用时间依赖性，见图1。

2.2 LDL对小鼠成骨细胞培养液中骨钙素水平的影响

ELISA实验结果显示在24 h浓度为0.05 mg/ml LDL明显抑制成骨细胞培养液中的骨钙素表达，与对照组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。单因素方差分析显示同一时间点，0.05、0.10、0.20 mg/ml LDL浓度组和对照组骨钙素水平差异显著(P＜0.01)，而同一浓度，24、48、72 h 不同作用时间骨钙素水平差异显著(P＜0.01)，提示LDL对成骨细胞骨钙素表达的抑制作用在一定程度上具有LDL剂量及作用时间依赖性(图2)。

2.3 LDL对小鼠成骨细胞LRP5、DKK1 mRNA表达的影响

荧光定量PCR实验结果显示在48 h浓度为0.05 mg/ml LDL明显下调成骨细胞中的 LRP5 mRNA表达水平，显著上调DKK1 mRNA表达水平，与对照组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。单因素方差分析显示当作用时间为24 h，0.05、0.10、0.20 mg/ml LDL 实验组和对照组 LRP5 mRNA相对表达量差异不显著(P＞0.05)，作用时间为48 h 和 72 h，0.05、0.10、0.20 mg/ml LDL 实验组和对照组LRP 5 mRNA相对表达量明显差异(P＜0.01)。同一浓度，24、48、72 h 不同作用时间LDL实验组LRP5 mRNA相对表达量差异显著(P＜0.01)。当作用时间为 24 h，0.05、0.10、0.20 mg/ml，LDL实验组和对照组DKK1 mRNA 相对表达量差异不显著(P＞0.05)，作用时间为48 h和 72 h，0.05、0.10、0.20 mg/ml LDL 实验组和对照组DKK1 mRNA相对表达量明显差异(P＜0.01)，同一浓度，24、48、72 h不同作用时间 LDL实验组DKK1 mRNA相对表达量差异显著(P＜0.01)，见图 3、4。

3 讨 论

骨的重建由骨的生成和吸收构成，成骨细胞具有骨的形成功能，破骨细胞具有骨吸收作用。两者之间的动态平衡是维持正常骨量的关键［5］。成骨细胞是骨形成、生长、发育的重要细胞之一，其起源于多功能骨髓基质的间质细胞，在骨形成过程中历经分裂增殖、分化成熟和基质钙化三个阶段。其中任何一个阶段出现异常时，都会对骨量和骨的组成产生重要的影响。目前有关胆固醇与骨密度关系的研究结果存在有分歧。既往的大量研究表明LDL水平与骨密度呈负相关［6-7］，本次研究发现LDL在24 h浓度为0.05 mg/ml时，明显抑制成骨细胞的增殖，LDL对成骨细胞增殖的促进作用在一定程度上呈LDL剂量及作用时间依赖性。LDL作用时间为48 h，浓度为0.20 mg/ml时，对该株细胞增殖的抑制作用最大，抑制率为63.48%。Brodeur等发现，10～50 μg/ml的ox-LDL促进成骨细胞的增殖，而150 μg/ml浓度以上的ox-LDL可杀死细胞，其机制与ox-LDL引发的溶酶体膜损伤有关［8］。Klein发现，LDL和ox-LDL可诱导Saos2成骨细胞凋亡，LDL可抑制Akt及其下游基因FKHR和GSK3的磷酸化，同时LDL可上调促凋亡基因Bcl-Xs和下调抗凋亡 Src激酶活性［9］。Brodeur等也发现，ox-LDL可诱导成骨细胞的凋亡，证明LDL在成骨细胞中具有多重功能。

骨钙素(OC)又称骨γ-羟基骨蛋白(BGP)或骨依赖维生素K蛋白，是由成骨细胞及肥大细胞合成分泌的一种小分子蛋白，含49个氨基·酸残基，分子质量5.8 kD。血清中OC水平变化直接反映成骨细胞活性，体外研究显示OC为成熟骨细胞的标志物，当骨组织矿化和成骨细胞分化增加时，OC也随之特异增加［10］。本次研究发现在24 h、浓度为0.05 mg/ml LDL明显抑制成骨细胞中的骨钙素表达，随着LDL浓度和作用时间的增加，抑制作用不断增强，说明LDL抑制成骨细胞中骨钙素的表达，证明LDL均参与调节了成骨细胞的分化。Taylor等发现，ox-LDL可与β-磷酸甘油协同作用诱导小牛主动脉平滑肌细胞分化，其机制可能与Osterix与Msx2基因的表达上调有关［11］。体外实验中，采用轻度氧化LDL或其他活性氧化脂质处理骨髓中前成骨细胞，发现成骨细胞分化标志物，如骨钙素等受到抑制;而前成骨细胞则在氧化脂质的诱导下向脂细胞分化;兔血清、脂肪酸和LDL氧化产物也能诱导成骨细胞系向脂肪样细胞分化［12］。

经典Wnt通路可调节成骨细胞的分化、骨基质的形成及矿化等环节并可影响破骨细胞的发生和骨吸收［13-14］。大量研究显示LRP5可通过Wnt/LRP5/β-连环蛋白途径直接调节成骨细胞功能及骨量［15-16］。抑制剂Dickkopf-1是由细胞内分泌的内源性蛋白质或生物活性物质［17］，它可通过作用于Wnt信号通路的上游分子卷曲蛋白和散乱蛋白起作用，从而产生拮抗Wnt通路的作用。目前确认的DKKl受体有低密度脂蛋白受体(LRP-5与LRP-6)［18］及含 kringle 结构域的 Kremen 蛋白受体［19］。DKK1直接与LRP受体结合，或者与其跨膜受体Kremen(Kremen-1，Kremen-2)结合后再与LRP5/6结合形成三聚体，诱导快速的细胞内吞，减少细胞膜上的LRP5/6，由此阻断了Wnt信号向胞内的传递［20］，使骨形成减少。实验也证实过度表达的DKK1能抑制骨髓基质细胞向成骨细胞分化，使成骨细胞数量减少，还能抑制骨基质的矿化及骨折后的修复［21-22］。

荧光定量PCR实验结果显示，在LDL在24 h浓度为0.05 mg/ml时明显下调成骨细胞中的LRP5 mRNA表达水平，显著上调DKK1 mRNA表达水平，提示HDL和LDL对成骨细胞增殖和分化的抑制作用可能与 wnt信号通路 LRP5及其抑制剂DKK1的表达有一定关系。

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