皂角刺总黄酮的含量测定＊

陈海霞 田吉 肖顺汉△

（1.泸州医学院药理学教研室，四川 泸州646000；2.泸州医学院药物与功能性食品研究中心，四川 泸州646000）

皂角刺（Spina Gleditsiae），为豆科植物皂荚Gleditsia sinensis Lam.的干燥棘刺，始载于《本草纲目》，已被列为抗癌中草药之一。中药化学成分含黄酮、皂苷、三萜、氨基酸等，能够增强机体免疫力，具有抗癌作用的部分主要是黄酮类化合物［1－2］。总黄酮含量测定的方法［3－4］主要有紫外可见分光光度法：测定含量时，样品中加入显色剂生成有色金属络合物，作用在光谱上能出现明显的吸收峰，这种紫外可见分光光度的方法又称为比色法。薄层扫描法是在样品经薄层分离后，在特定波长下用光度计直接测定其吸光度。随着科技的发展，还有其他如制备高效液相色谱法、荧光分光光度法、毛细管电泳法等广泛用于黄酮的含量测定。本文在参考诸多文献的基础上，结合现有条件，利用比色法测定皂角刺总黄酮含量，为评价黄酮类及其制品的质量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药材与样品

皂角刺干药材购于泸州百草堂饮片公司，由泸州医学院生药教研室税丕先老师鉴定。皂角刺总黄酮粗提物：取12kg皂角刺干药材，用粉碎机充分粉碎，打粉（20－30目），以8倍量（m∶v＝1∶8，g·mL－1）的50%乙醇加热回流提取两次［5－6］，每次1h，合并回流液并减压浓缩，回收乙醇溶剂，减压干燥，得0.48kg皂角刺干浸膏，放入干燥器缓慢烘干备用。皂角刺总黄酮纯化物：皂角刺总黄酮粗提物经聚酰胺纯化工艺获得。

1.2 试剂与仪器

芦丁对照品 （Purity≥98%，成都曼斯特生物有限公司），水为本院药研所自制纯净水。乙醇，亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠等均为分析纯。电子天平 （FA1604N，0.1mg，上海民桥精密科学仪器有限公司），紫外分光光度计（UV－2100，北京瑞利分析仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 对照品溶液的制备

精密称取120℃干燥至恒重的芦丁对照品5.3mg，至25 mL容量瓶中，加50%乙醇溶解，摇匀定容至刻度，即得浓度为0.21mg·mL－1的对照品溶液。

1.3.2 样品溶液的制备

（1）精密称取皂角刺总黄酮粗提细粉0.1076g至25mL容量瓶中，加50%乙醇溶解，摇匀定容至刻度，即得浓度为4.2mg·mL－1的样品溶液。（2）精密称取皂角刺总黄酮纯化细粉0.0463g至10mL容量瓶中，加50%乙醇溶解，摇匀定容至刻度，即得浓度为4.6mg·mL－1的样品溶液。

1.3.3 检测波长的选择

精密吸取芦丁对照品溶液3mL，至10mL具塞试管中，加入5%的NaNO2溶液0.3mL，摇匀后放置6min，加入10%的Al（NO3）3溶液0.3mL，摇匀后放置6min，再加入1moL·L－1NaOH溶液4mL，用50%乙醇稀释至刻度，摇匀，静置15min。置于比色皿中，以试剂空白作为参比［7］，照分光光度法，在200～900nm波长的范围内扫描，选择吸光度值最大时的波长为芦丁对照品的最大特征吸收波长。

1.3.4 标准曲线的绘制

精密 吸 取 芦 丁 对 照 品 液 0、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL，分别置于10mL具塞试管中，加5%亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，放置6min，加10%硝酸铝试液0.3mL，摇匀，放置6min，加1moL·L－1氢氧化钠试液4mL，用50%乙醇稀释至刻度，摇匀，放置15min，以第一份作为空白，于510nm波长处测定吸光度。

1.3.5 精密度试验

取同一供试品溶液5份，每份精密吸取0.2mL，照标准曲线项下方法测定含量。

1.3.6 稳定性试验

［8］，精密吸取同一供试品溶液，照标准曲线项下方法，每隔10min测定一次吸光度A值，连续测定至第60 min。

1.3.7 重复性试验

取同一皂角刺总黄酮样品5份，每份0.1076g，精密称定，照标准曲线项下方法测定含量。

1.3.8 加样回收率试验

精密称取样品（总黄酮粗提物，含量为58.84%）0.0538g，6份，编号1～6，1、2号（按样品黄酮含量∶对照品＝1∶0.8）加入芦丁对照品25.33mg，3、4号（按样品黄酮含量∶对照品＝1∶1）加入芦丁对照品31.66mg，5、6号（按样品黄酮含量∶对照品＝1∶1.2）加入芦丁对照品37.99mg。依法制备供试品溶液，并按含量测定项下方法测定，按公式计算回收率，回收率＝（实测黄酮含量－样品中黄酮含量）／黄酮对照品加入量×100%。

1.3.9 样品含量测定

精密吸取皂角刺总黄酮粗提物溶液0.2mL，置于10mL具塞试管中，加5%亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，放置6min，加10%硝酸铝试液0.3mL，摇匀，放置6min，加1moL·L－1氢氧化钠试液4mL，用50%乙醇稀释至刻度，摇匀，放置15min。置于比色皿中，以试剂空白作为参比，照分光光度法，于510nm波长处测定吸光度值。根据标准曲线方程及计算公式，计算出皂角刺总黄酮粗提物的含量。

按上述方法，精密吸取皂角刺总黄酮纯化物溶液0.1mL，于510nm波长处测定吸光度值，根据标准曲线方程及计算公式，计算出皂角刺总黄酮纯化后的含量。黄酮含量（%）＝（测出质量／取样体积×供试品总体积）／供试样品总质量×100%

2 结果

2.1 检测波长的确定

总黄酮样品溶液和对照品溶液显色后两者的峰型相似，在510nm处均有一个强吸收峰，结果表明，芦丁对照品在510nm处有最大吸收峰，故将510nm作为总黄酮的检测波长，见图1。

图1 芦丁标准品和总黄酮样品溶液吸收光谱

2.2 线性关系考察

以芦丁为标准品，显色测定以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，用最小二乘法得出回归方程为y＝1.1939x－0.0068，r＝0.9999，表明样品浓度在0.053～0.848 mg范围内与吸光度线性关系良好，见图2。

图2 芦丁标准曲线

2.3 精密度试验

由表1可知，五次测定吸收度的平均值为0.4455，每个样品测定的A值变化很小，相对标准偏差（RSD）为0.11%，表明仪器的精密度良好。RSD%＝S／X×100%，其中S为标准偏差，X为测量平均值。

表1 精密度试验

2.4 稳定性试验

实验表明在30min内吸收度（A）值保持稳定，60min后吸收度（A）值下降约9%，因此显色后应在30min内测定吸光度。

表2 稳定性试验

2.5 重复性试验

由表3可知，平均含量为58.50%，RSD为2.40%，表明本品重复性良好。

表3 重复性试验

2.6 加样回收试验

从表4可见，总黄酮平均回收率为96.7%，RSD为2.02%（＜3%），表明该方法不存在系统误差，可以作为皂角刺总黄酮含量的测定方法。

表4 加样回收试验

2.7 样品含量测定

由表5可见，经聚酰胺柱二次吸附、洗脱后，总黄酮含量从58.84%提高到了81.84%。

表5 皂角刺总黄酮含量测定

3 讨论

黄酮类物质是广泛存在于植物中的一类黄色素，在氧化剂亚硝酸盐存在的情况下，与硝酸铝生成黄色的黄酮铝络合物，遇碱呈红色，在可见光内出现稳定的吸收峰［9］，故本实验用紫外可见分光光度法（比色法）［10，11］测定皂角刺总黄酮含量。该法具有设备简单、适用性广、准确度和精密度较好等特点，在中药总黄酮含量分析中发挥着重要作用。在实际生产和科研过程中，高效液相色谱法（HPLC）适用于黄酮单体含量的测定，灵敏度高，但仪器价格昂贵；薄层扫描法操作麻烦，可行性差。

在对总黄酮比色法含量测定过程中，注意消除显色剂或供试液本身颜色可能存在的干扰。如果制得的待测液有不溶物析出，应考虑改变溶媒的比例或离心，使待测液澄明，以保证测得的吸收度值稳定［12］。

本实验中所采用的标准品芦丁只是一种典型的黄酮类化合物，并不能代表皂角刺中的黄酮类化合物，但由于它与皂角刺中的黄酮类化合物在分别经颜色反应后，于510nm处均有最大值，因此可以利用其颜色反应在可见分光光度计下绘制标准工作曲线，以测定总黄酮含量。今后可尝试以皂角刺中有代表性的黄酮类化合物如槲皮素等为标准品，利用HPLC对皂角刺总黄酮进行定量分析。

参考文献

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