结核分枝杆菌Ag85A DNA 疫苗的免疫原性和治疗作用

梁 艳，吴雪琼，，张俊仙，阳幼荣，李忠明

结核病(tuberculosis，TB)一直是备受关注的一个全球性健康问题。据世界卫生组织估计，全球约有1/3 人口感染结核分枝杆菌(mycobacterium tuerculosis，Mtb)，全世界每年都有新发结核病例830万，死亡病例180 万［1］。我国患结核病人数位居世界第二，每年新增结核病患者约150 万，受感染人数约4.5 亿。结核病的疫情给结核病的防治提出了新的挑战，结核病的免疫治疗成为研究的热点之一，治疗性疫苗的研究与开发成为一个十分重要的研究方向。在前期研究中笔者以载体CMV blue 构建了结核分枝杆菌Ag 85A DNA 疫苗［2］，发现该疫苗对结核病具有一定的免疫治疗效果。鉴于载体CMV blue 不能用于人，而采用美国FDA 建议的可用于人的质粒载体pVAX1 重新构建了结核分枝杆菌Ag 85A DNA 疫苗。本研究通过动物实验评价pVAX1－Ag85A DNA 疫苗的免疫原性和对小鼠结核病的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 DNA 疫苗和菌株来源 质粒载体pVAX1和结核分枝杆菌Ag85A DNA 疫苗由上海海规生物科技有限公司纯化，浓度均为1 mg/ml，纯度较高(A260/A280 = 2.06 ＞1.80)，几乎不含蛋白和RNA。结核分枝杆菌标准株H37Rv 由中国药品生物制品检定所提供;微卡菌苗购自安徽龙科马生物制药有限责任公司，规格22.5 μg/支。

1.1.2 药物和实验动物 利福平胶囊购自沈阳红旗制药有限公司，规格0.15 g;80 只6 ～8 周龄雌性BALB/c 小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.1.3 试剂盒 ELISPOT 试剂盒购自BD 公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA 疫苗的免疫原性

1.2.1.1 动物免疫分组 分为4 组，每组10 只小鼠。生理盐水组每只小鼠肌肉注射100 μl 生理盐水;pVAX1 载体组每只小鼠肌肉注射100 μg/100 μl pVAX1 载体;微卡菌苗组每只小鼠肌肉注射22.5 μg/100 μl 微卡菌苗;Ag85A DNA 疫苗组每只小鼠肌肉注射100 μg/100 μl Ag85A DNA 疫苗。各组小鼠每2 周肌肉注射1 次，共注射3 次。

1.2.1.2 酶联免疫斑点试验(ELISPOT) 小鼠第3 次免疫后14 d 杀鼠取脾脏，分离脾细胞，调节脾淋巴细胞浓度为4 ×106/ml。在测试板中，分别加入培养液、重组Ag85A 蛋白(终浓度为5 μg/ml)、植物血凝素(PHA)(终浓度为10 μg/ml)，脾淋巴细胞为4 × 105/孔，置CO2温箱中于37 ℃温育48 h，用ELISPOT 方法检测各组分泌IFN－γ 的T 淋巴细胞斑点数，以各组小鼠空白对照孔为对照，计算各组小鼠检测孔的细胞斑点数，按试剂盒说明书进行操作。

1.2.2 DNA 疫苗的治疗作用

1.2.2.1 小鼠结核病感染模型的制备 每只小鼠经尾静脉注射0.4 ml 含6.8 ×104的结核分枝杆菌标准株H37Rv 悬液，制备结核病模型。

1.2.2.2 实验分组 小鼠感染后，将小鼠随机均匀地分为4 组，每组10 只小鼠。小鼠感染后第3 天开始，生理盐水组每只小鼠肌肉注射100 μl 生理盐水;pVAX1 载体组每只小鼠肌肉注射100 μg/100 μl pVAX1 载体;利福平组每只小鼠口服利福平0.02 mg/(kg·d);Ag85A DNA 疫苗组每只小鼠肌肉注射100 μg/100 μl Ag85A DNA 疫苗。各治疗组每2周肌肉注射1 次，共注射3 次。

1.2.2.3 肺组织病理学检查 在治疗结束后2周，将小鼠肺右叶固定于10%中性甲醛，石蜡包埋切片，苏木精/伊红(HE)染色后，镜下观察肺组织病理改变。

1.2.2.4 肺、肝菌落计数 在治疗结束后2 周，取小鼠肺左叶称重，加生理盐水研磨，加等体积6%NaOH 消化30 min 后，倍比稀释取100 μl 接种于改良罗氏鸡卵平皿培养液上，置37℃温箱培养4 周，将得到的肺左叶菌落数根据肺左叶和全肺的重量换算为全肺菌落数;取部分肝称重，加生理盐水研磨，倍比稀释后取100 μl 接种于改良罗氏鸡卵平皿培养液上，置37℃温箱培养4 周，将得到部分肝的菌落数根据其重量和全肝的重量换算为全肝菌落数。

1.3 统计学处理 应用SAS6.12 软件处理数据，正态分布的定量资料用单因素方差分析，两两比较用t 检验;偏态分布的定量资料用秩和(Kruskal－Wallis)检验，两两比较用q(Student－Newman－Keuls)检验。

2 结果

2.1 小鼠分泌IFN－γ 的T 淋巴细胞斑点数pVAX1 载体组和微卡菌苗组均可见少量Ag85A 特异的分泌IFN－γ 的T 淋巴细胞，生理盐水组未见;而Ag85A DNA 疫苗组可见大量Ag85A 特异的分泌IFN－γ 素的T 淋巴细胞(图1)。与其他组相比，Ag85A DNA 疫苗能诱导产生大量的分泌IFN－γ 的T 淋巴细胞(S =11.832，P =0.0080)，表明Ag85A DNA 疫苗显著增强小鼠特异的细胞免疫功能。

2.2 肺脏组织病理改变 治疗结束后2 周，各治疗组小鼠肺组织的镜下病理改变见图2。生理盐水组肺组织病变严重、广泛，实变，肺泡结构破坏显著，肺泡壁重度肿胀、增厚，可见少量的淋巴细胞浸润。pVAX1 载体组病变程度比生理盐水组稍轻，肺泡壁中度、重度增厚，小部分区域肺泡结构完整。利福平组无病变，肺泡结构完整，清晰，肺泡上皮延续。Ag85A DNA 疫苗组肺组织病变较局限，以肉芽肿样增生性病变为主，3/5 区域肺泡结构完整，清晰，肺泡上皮延续。病变区域出现典型的由类上皮细胞、多核巨细胞、泡沫样细胞和少量淋巴细胞组成的结核肉芽肿。

图2 各组小鼠肺组织病理结果(HE，×40)

2.3 肺、肝活菌计数 治疗结束后2 周，治疗组全肺菌落数由多到少依次是生理盐水组、pVAX1 载体组、Ag85A DNA 疫苗组和利福平组，分别为(6.41 ±0.25)log、(6.16 ±0.35)log、(5.68 ±0.40)log 和(4.30 ±0.44)log。与生理盐水组比较，pVAX1 载体组肺脏菌落数略有减少，但差别无统计学意义;利福平组、Ag85A DNA 疫苗组肺脏菌落数分别减少2.11 log 和0.73 log(P ＜0.01)。全肝菌落数由多到少依次是生理盐水组、pVAX1 载体组、Ag85A DNA 疫苗组和利福平组，分别为(5.53 ±0.31)log、(5.47 ±0.29 )log、(4.65 ±0.23)log 和(3.42 ±0.44 )log。与生理盐水组比较，pVAX1 载体组肝脏菌落数略有减少，但差别无统计学意义;利福平组、Ag85A DNA 疫苗组肝脏菌落数分别减少了2.11 log和0.88 log(P ＜0.01)。

3 讨论

DNA 疫苗由能引起机体保护性免疫应答的病原体抗原的编码基因和载体组成，将其直接导入机体细胞后，并不与宿主染色体整合，而是通过宿主细胞的转录系统表达蛋白抗原，诱导宿主产生细胞免疫应答和体液免疫应答。很多研究表明DNA 疫苗可以刺激机体产生并长期维持所需的细胞免疫应答，与抗结核化疗相结合不仅可提高机体免疫力，而且可以提高化疗效果，缩短疗程［2－7］，因而可能成为结核病治疗的新途径。

Ag85A 是结核分枝杆菌和BCG 主要的分泌性蛋白，Denis［3］研究了Ag85A DNA 疫苗免疫的BALB/c 小鼠的抗原特异性CD4+和CD8+T 细胞反应，证实Ag85A DNA 免疫疫苗可产生更强、更广泛的T 细胞反应和CTL 活性。Huygen［4］报道，用Ag85 复合物编码基因免疫小鼠，可诱导产生很强的细胞和体液免疫反应，抵御活结核分枝杆菌和卡介苗的攻击。近年来国内外学者在结核DNA 疫苗方面进行了一系列的研究，其中在Ag85A DNA 疫苗上取得了良好的实验效果［2－8］。因此本文在前期研究的基础上，进一步评价Ag85A DNA 疫苗治疗小鼠结核病的疗效。

IFN－γ 常被认为是抵抗结核分枝杆菌感染的一个关键性细胞因子，也是Th1 型细胞免疫反应的重要指标，基因免疫抗结核病的保护性效应与分泌IFN－γ 的淋巴细胞的产生密切相关［9］。本研究发现，从分泌IFN－γ 的T 淋巴细胞数看，与其他组比较，Ag85A DNA 疫苗能诱导产生大量的分泌IFN－γ 的T 淋巴细胞，表明Ag85A DNA 疫苗显著增强小鼠特异的细胞免疫功能。从肺、肝细菌载量来看，与生理盐水组比较，Ag85A DNA 疫苗组肺脏活菌数和肝脏活菌数均有显著减少，分别减少了0.73 log 和0.88 log，表明Ag85A DNA 疫苗对小鼠结核病具有显著的治疗作用。但其治疗作用不如利福平，其原因可能在于Ag85A DNA 疫苗是通过增强机体的细胞免疫功能间接抑制结核菌的生长，而利福平是全杀菌药，可以直接杀灭结核菌。从肺脏病损程度和组织病变评价，与生理盐水组和载体组病变严重、广泛相比，Ag85A DNA 疫苗组肺脏病变减轻，病变局限，3/5 区域可见肺泡结构完整，清晰，且与肺菌落计数相一致。以上研究结果表明，Ag85A DNA 疫苗对小鼠结核病具有一定的治疗作用。在前期研究中，笔者用Ag85A DNA 疫苗治疗小鼠耐多药结核病模型，发现Ag85A DNA 疫苗对耐多药结核病也有疗效［7，8］。

综上所述，Ag85A DNA 疫苗主要刺激Th1 型的免疫反应，能显著增强小鼠特异的细胞免疫功能，有望成为治疗结核病新的免疫制剂，为临床上结核病治疗开辟一条新途径。

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［2］ 吴雪琼，张俊仙，李洪敏，等. 结核分枝杆菌Ag85A DNA 疫苗免疫治疗作用的研究［J］. 中国免疫学杂志，2002，18(1):17－22.

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［4］ Huygen K，Content J，Denis O，et al. Immunogenicity and protective efficacy of a tuberculosis DNA vaccine［J］. Nat Med，1996，2(8):893－898.

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［6］ Ha S J，Jeon B Y，Youn J I，et al.Protective effect of DNA vaccine during chemotherapy on reactivation and reinfection of Mycobacterium tuberculosis［J］.Gene Therapy，2005，12(7):634－638.

［7］ Liang Y，Wu X Q，Zhang J X，et al.The treatment of mice infected with multi－drug－resistant Mycobacterium tuberculosis using DNA vaccines or in combination with rifampin［J］.Vaccine，2008，26(35):4536－4540.

［8］ Liang Y，Wu X，Zhang J，et al. Treatment of multi－drug－ resistant tuberculosis in mice with DNA vaccines alone or in combination with chemotherapeutic drugs［J］.Scand J Immunol，2011，74(1):42－46.

［9］ Derrick S C，Repique C，Snoy P，et al.Immunization with a DNA vaccine cocktail protects mice lacking CD4 cells against an aerogenic infection with Mycobacterium tuberculosis［J］.Infect Immun，2004，72(3):1685－1692.