超声辅助萃取-高效液相色谱荧光检测法测定贻贝中的多环芳烃

陈雪昌，孙秀梅，胡红美，陈 朋，郭远明，梅光明

（浙江海洋学院海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，浙江省海水增养殖重点实验室，浙江舟山 316100）

多环芳烃（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs）是一种持久的环境和食品有毒污染物，广泛分布于土壤、水体、空气、食品以及一些日常用品中。其在环境中虽含量不高，由于难以通过生物降解消除，会经过过食物链逐步富集浓缩会逐渐达到相当高的含量。因此，寻找一种简单、快速、高灵敏的多环芳烃的分离分析技术具有重要的意义。

目前，多环芳烃主要采用高效液相色谱法（HPLC）[1-2]、高效液相色谱质谱法（HPLC-MS）[3]，气相色谱法（GC）[4-5]、气相色谱-质谱法（GC-MS）[6]、毛细管电泳分析法（CE）[7]、薄层扫描法[8]、超临界流体色谱法（SFC）[9]以及荧光光度法[10]，分析检测。分析对象多为大气，水体，沉积物，鱼、虾等水产品。

贻贝作为人类的食物，又是海洋食物链的一环，有国际贻贝监测报告[11]认为，用贻贝作为近海污染指示物，比选择像海藻、鱼类或海水更具有代表性和价值。本文以贻贝为研究对象，建立了超声辅助萃取-高效液相色谱荧光检测法测定贻贝中的多环芳烃的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

紫贻贝Mytilus edulis：新鲜，购自舟山市普陀东河市场。

1.2 主要试剂

环己烷、二氯甲烷（农残级，美国J T Baker公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；氢氧化钾（优级纯，中国医药集团上海化学试剂公司）；无水硫酸钠（分析纯，上海化学试剂总厂），使用前650℃烘干4 h；硫酸（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；多环芳烃混合标准储备液：分别称取一定量的荧蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘，苯并[g,h,i]芘和茚并[1,2,3-cd]芘标准品（中国计量科学研究院），用丙酮定容至10 mL，配置成10 mg/L混合标准储备溶液，4℃避光保存，使用时用流动相逐级稀释至所需浓度。

1.3 主要仪器与设备

Waters Alliance高效液相色谱仪（美国Waters公司），配2695荧光检测器；高速离心机（德国Eppendorf公司）；涡旋混合器（德国Ika公司）；旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司）；Florisil固相萃取柱（250 mg，3 mL，德国CNW Technologies GmbH公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 样品制备

将紫贻贝用海水洗净泥沙，滤干水分。用小刀剥开外壳，取出整个贻贝。称取约250 g置于高速组织捣碎机中制成匀浆。

1.4.2 样品提取

准确称取5.00 g试样，置于50 mL聚四氟乙烯管中，加入25 mL甲醇和10 mL 50%的氢氧化钾溶液，超声萃取1 h（30℃）后，6 000 r/min离心5 min，提取上清液于另一50 mL聚四氟乙烯管中，加入10 mL环己烷，超声10 min（30℃），2 000 r/min涡旋2 min，6 000 r/min离心5 min，吸取上层环己烷于125 mL分液漏斗中，下层液体再用10 mL环己烷重复萃取2次，合并环己烷层。

环己烷萃取液依次用10 mL 50%甲醇/水溶液、5 mL水、5 mL水和1 mL 60%硫酸溶液重复振摇，静置分层，弃去下层液体，并用30 g/L硫酸钠水溶液洗环己烷层至中性，以达到清洗萃取液目的，将环己烷层经无水硫酸钠脱水后转移至100 mL梨形瓶中，在40℃水浴中旋转蒸发（35 r/min，152 mbar），浓缩至1～2 mL即可。

1.4.3 样品净化

依次用3 mL二氯甲烷、5 mL环己烷活化Florisil固相萃取柱。将浓缩后的提取液转移至柱子中，并依次用1 mL、2 mL环己烷清洗梨形瓶，全部转移至柱子中；用9 mL环己烷-二氯甲烷溶液（3:1，v/v）洗脱，收集于100 mL梨形瓶中，40℃水浴中旋转蒸发（35 r/min，152 mbar）至干。准确加入2 mL乙腈，充分溶解后，用0.22 μm微孔滤膜过滤，供高效液相色谱仪测定。

1.4.4 色谱工作条件

色谱柱：Supelcosiltm LC-PAH 柱（250 mm×4.6 mm×5.0 μm）；流动相：乙腈-水（65:35，v/v）；流速：1 mL/min；柱温：30℃；进样量：20 μL；以保留时间定性，外标法-峰面积定量。

2 结果与讨论

2.1 检测条件的选择

多环芳烃常用的检测器有紫外、荧光、化学发光等方法，通常紫外检测法灵敏度较低，而化学发光检测法虽然无需光源、背景噪音低，检测灵敏度高，但需要引入化学发光反应。本研究选择操作简单，灵敏度高的荧光检测法。根据各化合物保留时间、最大吸收波长设定相应的荧光条件。苯并[b]荧蒽和苯并[k]荧蒽性质相近，选择同一荧光条件。各多环芳烃的荧光检测程序见表1。

表1 6种多环芳烃的荧光检测程序Tab.1 Fluorescence detection program for six PAHs

2.2 色谱分离条件

为了获得满意的分离度，对流动相、柱温、流速等因素进行了考察，得到的优化结果见1.4.4。优化条件下，6种多环芳烃标准品色谱图如图1。结果表明，该条件下，6种多环芳烃实现了很好的分离。

图1 6种多环芳烃（10 μg/L）标准品色谱图Fig.1 Chromatogram of 6 kinds of PAHs standard

2.3 萃取方式的选择

本试验选择超声波辅助萃取法，操作简单，萃取效率高。首先，试样中加入皂化剂超声处理，有效的除去脂类物质的干扰。接着加入环己烷对皂化后的上清液超声萃取，使亲脂性的多环芳烃转移进入环己烷层。

2.4 提取液净化

试样经造化萃取后，还残留痕量的脂肪族化合物和一些极性较强的组分，需要进一步净化。采用甲醇-水体系能有效去除正己烷层中脂肪组织水解的脂蛋白。60%硫酸溶液可以有效地净化生物样品中脂肪和其他杂质。

比较了C18和Florisil柱的净化效果，确定选择对分离脂肪族和芳香族化合物效果较好的Florisil柱为固相萃取柱。

2.5 工作曲线和检出限

用流动相稀释多环芳烃混合标准储备液，得到0.002～0.5 mg/L混合标准工作溶液，按照色谱工作条件进行检测。结果表明，6种多环芳烃在0.002～0.5 mg/L范围内呈线性关系，工作曲线、相关系数及检出限见表2。

表2 方法线性回归方程和检出限Tab.2 The linear regression equations and determination limits of the proposed method

2.6 回收率和精密度试验

采用标准加入法对待测试样进行加标回收率和精密度试验，以考察方法的准确性和重现性。对市售的紫贻贝，进行样品制备后，分别加入高（500 μg/kg）、中（100 μg/kg）、低（10.0 μg/kg）3 种浓度水平混合标准溶液，平行测定6次，实验结果见表3。结果表明，3个加标浓度下，回收率为78%～92%，相对标准偏差为2.8%～6.3%，满足分析检测要求。

表3 方法的回收率和精密度试验结果（n=6）Tab.3 Result of test of recovery and precision of the proposed method(n=6)

3 结论

本工作建立了超声波辅助萃取-高效液相色谱荧光检测法测定紫贻贝中6种多环芳烃的方法。方法灵敏，超声萃取简单，重现性好，准确度高，实验结果令人满意，可以适用于贻贝中多环芳烃的检测，并有望应用于其他水产品中多环芳烃的检测。

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