10种常见中草药水提物对嗜水气单胞菌ZHYYZ-1的体外抑菌效果研究

赵蓓蓓，赵 晶，王志铮，吕敢堂，何 凯

（浙江海洋学院水产学院，浙江舟山 316004）

嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophia系自然界中具复杂血清型且易于变异的常在菌，广泛存在于淡水、土壤、污水、淤泥和人的粪便中[1]，有致病性和非致病性菌株之分。其中，致病性嗜水气单胞菌可感染人和各种动物，据统计该菌对淡水鱼类的感染率达90%以上，死亡率达65%以上，流行遍及我国20多个省市[2]，属典型的人-兽-鱼共患病病原菌[3]。

目前对由致病性嗜水气单胞菌感染引起的水产动物相关疾病的防控和治疗，仍主要依赖传统的化学消毒剂、抗生素[4]。因长期使用，不仅使该致病菌的耐药性不断增强[5]，而且也导致养殖动物体内药物残留量日趋增多[6]。新兴免疫增强剂[7-8]、益生菌剂[9]、疫苗[10]等虽对防控嗜水气单胞菌病有一定的效果，但其使用的局限性、对生物体的刺激性及操作的复杂性阻碍了它们的广泛应用，这也是导致水产养殖动物嗜水气单胞菌病难以有效防除和根治的重要原因之一。

近期研究表明，中草药对水生经济动物具有免疫、抗菌双向调节作用[11]，且易降解、无残留、无毒副作用[12]，是一类极具开发前景的纯天然渔药资源。国内学者就中草药对嗜水气单胞菌的体外抑菌实验结果表明，五倍子、黄芩、蒲公英、板蓝根等常见中草药对致病性嗜水气单胞菌有较好的抑制效果[13-16]，而关于中草药复方对该菌防控效果的定量研究迄今尚未见报道。为从定量水平明晰中草药组合对该菌的抑菌效果，找寻对该菌具协同抑菌效应的中草药组合，本研究采用琼脂稀释法从10种常见中草药中筛选出对致病性嗜水气单胞菌ZHYYZ-1具较强抑菌效果的单方，并通过两两组配，观察了各中草药组合对该菌的抑菌作用，以期为水产动物嗜水气单胞菌病的防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验菌及菌液制备

嗜水气单胞菌ZHYYZ-1（Genbank登录号：GU5639920），由浙江海洋学院水产养殖实验室安全养殖分室提供。将其接种于无菌营养肉汤培养基，30℃恒温培养20 h进行活菌计数，将已知菌浓度的菌液配成含15%甘油的混合液保存于-80℃冰箱备用。

1.2 实验中草药及药平板的制备

实验用中草药蒲公英Taraxacum officnala、黄连Coptis chinensis、黄芩Scutellaria baicalensis、金银花Lonicera japonica、五倍子 Rhus chinensis、穿心莲 Andrographis paniculata、鱼腥草 Houttuynia cordata、连翘Forsythia suspensa、大青叶Folium isatidis和板蓝根Isatidis Radix等均为由陕西中鑫生物技术有限公司生产的10倍水提物粉剂（粒径小于等于0.2 mm，本文所涉及药液浓度均换算为单倍计算）。经预实验，确定各单方药平板的初始含药量（基础培养基为水解酪蛋白培养基，其成分为牛肉浸出粉30 g/L，可溶性淀粉1.5 g/L，酪蛋白水解物 17.5 g/L，琼脂 17 g/L；pH 为 7.3±0.2，购自杭州微生物试剂有限公司），通过倍比稀释制成梯度含药平板。

1.3 实验中草药体外抑菌效果的观察

依据实验菌致中华鳖稚鳖感染与致死的定量研究结果[17]，本研究将该菌的实验浓度梯度依次设置为1.0×104CFU/mL、1.0×105CFU/mL、1.0×106CFU/mL 和 1.0×107CFU/mL。同一梯度含药平板仅均匀涂布某一实验菌浓度梯度，涂布菌量为100 μL，每块含药平板重复2次，30℃恒温培养24 h后观察结果，以实验平板上无菌落生长的最小中草药浓度判为最小抑菌浓度。

1.4 中草药两两组配的体外抑菌效果

基于实验菌致中华鳖稚鳖不表露临床感染的最高注射菌量为1.0×104CFU/只[17]，故本研究将对1.0×104CFU/mL实验菌浓度梯度具强抑菌效果中草药的最小抑菌浓度计为1个抑菌强度单位，并按A,0.2A+0.8B，0.4A+0.6B，0.6A+0.4B，0.8A+0.2B，B 进行两两组配(A、B 分别为两种单方的最小抑菌浓度，本研究将同一实验菌浓度梯度水平下A、B实验组中抑菌作用的最强者视为对照组)，制作含药平板，观察它们对实验菌的体外抑菌效果（实验菌浓度梯度设置为 1.0×104CFU/mL、1.0×105CFU/mL、1.0×106CFU/mL 和 1.0×107CFU/mL）。同一实验菌浓度梯度水平中，以平均残留菌量较对照组低一个数量级以上者判为抑菌协同效应，较对照组高一个数量级以上者判为抑菌拮抗效应，其余判为相互独立作用。

2 结果与分析

2.1 中草药对实验菌的体外抑菌效果

列实验菌不同浓度梯度中草药单方的最小抑菌浓度于表1。由表1可见，10种中草药对实验菌的抑菌作用由强至弱依次为五倍子、黄芩、金银花、蒲公英、连翘、黄连、穿心莲、鱼腥草、板蓝根和大青叶，五倍子、黄芩、金银花、蒲公英对实验菌的抑菌效果明显优于其他6种中草药，尤以五倍子为佳，四者对1.0×104CFU/mL 浓度菌液的最小抑菌浓度（MIC）分别为：0.20 mg/mL、1.56 mg/mL、1.56 mg/mL 和 3.12 mg/mL。

表1 10味中草药单方对不同浓度菌液的最小抑菌浓度MIC（mg/mL）Tab.1 The minimal inhibitory concentration of ten Chinese herb for differernt concerntrention

2.2 中草药两两组合对实验菌的体外抑菌效果

由表2可见，（1）实验菌浓度1.0×107CFU/mL时，蒲公英-黄芩、黄芩-金银花、蒲公英：黄芩=3:2和黄芩：五倍子≥3:2组合均表现为抑菌协同效应，蒲公英-五倍子、金银花-五倍子两组合均表现为抑菌相互独立作用；（2）实验菌浓度1.0×106CFU/mL时，蒲公英-黄芩、黄芩-金银花、蒲公英：金银花≤3:2和黄芩：五倍子≥3:2组合均表现为抑菌协同效应，而蒲公英-五倍子、金银花-五倍子两组合则均表现为抑菌拮抗效应；（3）实验菌浓度1.0×105CFU/mL时，蒲公英-黄芩、黄芩：五倍子≥2:3组合均表现为抑菌相互独立作用，黄芩-金银花、蒲公英：金银花≤3:2组合均表现为抑菌协同作用，而蒲公英-五倍子、金银花-五倍子组合均表现为抑菌拮抗效应；（4）实验菌浓度1.0×104CFU/mL时，蒲公英-黄芩、黄芩-金银花、蒲公英：金银花≤3:2和黄芩：五倍子≥2:3组合均表现为抑菌相互独立作用，蒲公英-五倍子，金银花-五倍子两组合均表现为抑菌拮抗作用。

表2 4种中草药两两组配的体外抑菌效果（mg/mL）Tab.2 The effect of bacterial inhibition for differernt compose of two Chinese herb

3 讨论

中草药单方对细菌的抑菌效果强弱与中草药的有效抑菌成分及实验菌的种类有关。本研究10种中草药对革兰氏阴性杆菌均有一定的抑菌作用。其中五倍子的主要抑菌成分为没食子酸和鞣酸，鞣酸对蛋白质具沉淀作用[18]；黄芩的主要化学成分为黄芩素和黄芩苷[19]，可以作用于酶系统或功能蛋白[20]；蒲公英的主要抑菌成分为萜类、黄酮类-木犀草素[21]，其抑菌机制主要是通过抑制DNA拓扑异构酶的活性，进而影响菌体核酸及蛋白质的合成[22]；金银花主要抑菌成分为绿原酸、异绿原酸等[23]；连翘则主要借助其种子的挥发油起抑菌作用[24]；有学者从鱼腥草内也提取到一种类似挥发油成分，黄连的有效抑菌成分为小檗碱，其对革兰氏阳性菌的抑菌效果优于对革兰氏阴性菌的抑菌效果；板蓝根和大青叶均含靛蓝、靛玉红等，对痢疾杆菌有一定的抑菌效果[18]。

姜巨峰等[25]指出五倍子对嗜水气单胞菌具极强的体外抑菌作用，当菌浓度2.5×107CFU/mL时，其最小抑菌浓度仅为0.78 mg/mL；李茜等[26]认为蒲公英能有效抑制嗜水气单胞菌的生长；高汉娇等[13]发现黄芩、蒲公英、金银花对嗜水气单胞菌的抑菌作用呈黄芩＞蒲公英＞金银花；另有研究表明，在嗜水气单胞菌1.0×104CFU/mL时黄连、连翘、大黄、鱼腥草、大青叶对嗜水气单胞菌的抑菌作用呈黄连＞连翘＞大黄＞鱼腥草＞大青叶[27]；上述与本研究10种中草药对实验菌的体外抑菌作用呈五倍子＞黄芩＞金银花＞蒲公英＞连翘＞黄连＞穿心莲＞鱼腥草＞板蓝根＞大青叶的结果基本一致。至于，宋学宏等[28]采用中草药醇提物对嗜水气单胞菌强毒株的抑菌作用呈板蓝根＞蒲公英，与本研究结果相异，可能是由提取方法的不同引起的。

张文青等[29]研究发现儿茶、五倍子、五味子和乌梅按4:2:4:1和1:2:2:4的比例配伍时对嗜水气单胞菌分别具最佳的抑菌和杀菌作用。表明中草药复方的抑菌效果不仅取决于各单方的有效抑菌成分，还与药物间的相互作用及配伍比例密切相关。郑曙明[30]在分析一例五倍子复方的抑菌药效时指出，该复方中五倍子的主要抗菌成分没食子酸含量最高，达10.47%，其次是黄酮类中的槲皮素和黄芩苷，且黄芩苷的抑菌效果大于槲皮素，而黄芩苷来源于复方中的黄芩，表明五倍子与黄芩组配对嗜水气单胞菌有较好的抑菌协同效果。本研究中黄芩：五倍子≥3:2时对1.0×106～1.0×107CFU/mL实验菌表现为抑菌协同效应，黄芩：五倍子≥2:3时对1.0×104～1.0×105CFU/mL实验菌表现为抑菌相互独立作用，既印证了郑曙明[30]分析结果的可靠性，也揭示了五倍子、黄芩组配比例对抑菌效果的重要性，即两者只有在一定的配比条件下才具有抑菌协同效果。至于，本研究蒲公英-黄芩、黄芩-金银花两组合的各组配比例对 1.0×106～1.0×107CFU/mL实验菌均表现为抑菌协同效应，而蒲公英-五倍子，金银花-五倍子两组合的各组配比例对1.0×104～1.0×106CFU/mL实验菌均表现为抑菌拮抗效应，其机理有待进一步研究。

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