微生物脱支酶研究进展

王红梅　潘仁瑞　吴茜茜　张敏　蔡敬民

摘要回顾了微生物来源的脱支酶的研究历史，重点介绍普鲁兰酶、异普鲁兰酶、异淀粉酶和新普鲁兰酶的特点和区别，以及其在国内、外的研究进展，并对其应用进行概述和展望。

关键词微生物脱支酶；普鲁兰酶；异普鲁兰酶；异淀粉酶；新普鲁兰酶

中图分类号Q814文献标识码A文章编号 1007-5739（2011）13-0041-04

1928年，日本某酒厂的研究人员Nishimura[1]报导利用酵母自溶产物中的酶来液化淀粉，这种酶可以促进经过淀粉酶处理的淀粉糖化，并建议将此酶命名为支链淀粉酶（Amylopecti- nase）[1]。在继续的研究中，他用从酵母中提取的酶处理糯米淀粉液，随着保温时间的延长，碘显色反应由红色变为紫色，而其沉淀物则为蓝-紫色，他认为这是一种“合成”淀粉的酶，因而命名为淀粉合成酶（Amylosynthease）[2]。Minagawa继续上述研究，从微生物到高等植物，试验内容比较广泛，但没有取得实质性的进展[3-4]。

经过大约15年，东京大学农化系的Maruo等[5-8]对上述酵母产生的所谓“淀粉合成酶”产生怀疑，又对其进行了系统的研究：包括采用粘度法或渗透压法分别测定糯米淀粉和酶反应后形成产物的平均分子量、碘的显色反应、被β-淀粉酶转化的限度以及丁醇沉淀等试验。最后得出结论：糯米的支链淀粉由于酶的作用生成了分子量较小的直链淀粉，所以在碘显色反应等方面发生了变化，这种酶作用于支链淀粉型多糖的α-1，6-糖苷键，是一种特殊类型的淀粉酶，则建议命名为“异淀粉酶”（Isoamylase），以取代原来易引起人们误解的“淀粉合成酶”。该文主要讨论微生物来源的脱支酶（Debranching enzymes），也部分涉及到植物来源的脱支酶。

1微生物来源的脱支酶[9]

1.1普鲁兰酶（Pullulanase，EC3.2.1.41）

系统名为普鲁兰6-葡聚糖水解酶（Pullulan 6-gluca-nohydrolase），亦称茁霉多糖酶、支链淀粉酶、淀粉-1，6-葡萄糖苷酶（Amylo-1，6-glucosidase），也有误称极限糊精酶（Limit dextrinase）。其专一地水解普鲁兰糖的α-1，6-糖苷键，生成麦芽三糖。不同菌种来源的酶其专一性略有差异，产气杆菌（Aerobacter aerogenes，现归类于克雷伯氏菌属Klebsiella）产生的酶能使支链淀粉和它的β-极限糊精去分支，对天然糖元没有活性；而蜡状芽孢杆菌蕈状变种（Bacillus cereus var.mycoides）产生的酶，对支链淀粉几乎没有活性，却能作用于它的β-极限糊精。

1.2异普鲁兰酶（Isopullulanase，EC3.2.1.57）

系统名为普鲁兰4-葡聚糖水解酶（Pullulan 4-glucanohy-drolase），亦称异茁霉多糖酶，异支链淀粉酶。其催化普鲁兰水解，产生异潘糖（isopanose，6-α-maltosylglucose）；也能以潘糖（panose，4-α-isomaltosylglucose）为底物，酶解产物为异麦芽糖和D-葡萄糖；但对淀粉的作用较弱。

1.3异淀粉酶（Isoamylase，EC3.2.1.68）

系统名为糖元6-葡聚糖水解酶（Glycogen 6-glucanohy-drolase）。其水解糖元、支链淀粉及其β-极限糊精的α-（1，6）-D-葡糖苷键，但不能作用于普鲁兰糖，仅能水解分支点的1，6键。该酶对糖元的作用是完全的，可完全脱支；但只能有限度地作用于α-极限糊精，即仅能使某些α-极限糊精脱支。

1.4新普鲁兰酶（Neopullulanase，EC3.2.1.135）

新普鲁兰酶亦称新茁霉多糖酶。其水解普鲁兰糖主要产生潘糖，该酶通过3个步骤起作用：①酶仅作用于普鲁兰糖的α（1→6）键的非还原侧的α（1→4）葡糖苷键，产生潘糖和一些中等的潘糖寡聚物；②酶对6（2）-O-α-（6（3）-O-α-葡糖基麦芽三糖基）-麦芽糖水解α（1→4）或α（1→6）键，产生潘糖和麦芽糖；③水解6（3）-O-α-葡糖基麦芽三糖的α（1→4）键，产生葡萄糖和另一个潘糖。酶的单一活性中心参与对α（1→4）和α（1→6）键的双重活性，这个同一位点也催化转糖基反应：形成α（1→4）-葡糖苷键和形成α（1→6）-葡糖苷键。

此外，极限糊精酶（Limit dextrinase，EC3.2.1.142），也称R-酶或支链淀粉-1，6-糖苷酶（Amylopectin-1，6-gluco-sidase）。其催化支链淀粉和糖元的α-和β-极限糊精中的（1→6）-α-O-糖苷键水解，也作用于普鲁兰。因此，在早期的文献中常和普鲁兰酶混用，一般的区分是将来源于微生物的酶称普鲁兰酶，而来源于植物的酶称R-酶或极限糊精酶。

24种脱支酶的国内外研究现状

2.1普鲁兰酶

普鲁兰酶是1961年德国学者Bender和Wallenfels[10]在研究一株产气杆菌（Aerobacter aerogenes）时首次发现的，它的特异性底物是普鲁兰（一种以α-1，6-糖苷键连接麦芽三糖构成的链状多糖）。普鲁兰酶以随机内切方式切断普鲁兰的α-1，6-糖苷键形成麦芽三糖。此后陆续发现许多微生物也可以合成此酶。1966年，Wallenfels和Bender[11]又对该酶进行了分离纯化和性质研究，纯酶的分子量为70～80 kDa，最适pH值为5，100 ℃加热3 min，恢复室温后，酶活可恢复到80%，热稳定性较好。1975年日本学者Takasaki[12]报导了蜡状芽孢杆菌蕈状变种可同时产生β-淀粉酶和普鲁兰酶，该酶最适作用条件为pH值6.0～6.5，温度50 ℃；水解淀粉产生麦芽糖其最大转化率为95%。1987年Takasaki[13]又报导一株芽孢杆菌（Bacillus subtilis TU）也同时产生淀粉酶和普鲁兰酶；该酶最佳作用pH值为7.0～7.5，反应温度60 ℃，在pH值5.0时仍有约50%的活力；在上述条件下可水解淀粉为麦芽三糖和麦芽糖，水解普鲁兰糖为麦芽三糖。

丹麦Novo公司在1980年初获得一株嗜酸性分解普鲁兰多糖芽孢杆菌（Bacillus acido-pullulyticus），此菌产生的普鲁兰酶可耐pH值4.5，最适反应温度60 ℃。商品名为Pro-mozyme-200L，1983年在欧洲和日本市场同时商业化销售，迄今仍是销售最大、应用最广的品种。1985年，Takizawa[14]等成功克隆Klebsiella aerogenes普鲁兰酶的基因并在大肠杆菌中表达。

我国对脱支酶的研究起步较晚，江西食品发酵工业科学研究所于1973年开始从保藏菌株中筛选出一株产异淀粉酶活力较高的产气杆菌10016[15]。在500 L发酵罐试验，酶活力可稳定在500 U/mL以上。发酵液经过滤后用硫酸铵盐析，获得粗酶制剂。该酶作用的最适pH值为5.6～7.2，pH值在5以下不稳定；最适反应温度为45～50 ℃，50 ℃以上不稳定，55～60 ℃间酶活急剧下降。戈苏国等[16]对上述粗酶制剂（酶活力为43 000 U/g）进行了纯化并获得纯酶，结果表明：纯酶作用的最适pH值为5.3～5.8，在pH值4.3～8.6的范围内稳定；最适温度为50 ℃，耐热性较差，在50 ℃处理4 h后剩余酶活仅有10%；分子量51～52 kDa，糖蛋白含糖6.5%～7.0%。底物水解特异性试验结果显示该酶专一水解茁霉多糖、糯米淀粉，也能分解糊精，不作用于糖原、纤维二糖及环状糊精。因此，认为该酶不应归类于异淀粉酶（EC3.2.1.9此编号后来被废止），而应称为茁霉多糖酶（即普鲁兰酶）。张锡清等[17]继续研究了该酶的后处理技术，比较了变性淀粉吸附、离子交换层析、真空浓缩、超滤和酒精沉淀等制造液体浓缩酶方法的优劣，表明超滤技术最适用于酶的浓缩分离，此法操作简单，可在低温低压下进行，具有节约能源、无相态变化、产品得率高等优点。

随着该酶的应用发展，对耐酸、耐碱和耐热性普鲁兰酶的研究逐渐增多。1987年德国Madi和Antranikian[18]从保藏菌株中选出一株耐热产硫梭菌（Clostridium thermosulfuro-genes），能同时产生耐酸、耐热的α-淀粉酶和普鲁兰酶；普鲁兰酶作用的最适pH值为4.5～6.0，最适温度60～70 ℃。2001年唐宝英等[19]从土壤中分离出一株产生普鲁兰酶的芽孢杆菌，该酶最适反应温度和pH值分别为75 ℃和4.6；在55 ℃反应条件下，酶在pH值4.0～8.0范围内的活性稳定。2002年马晓军等[20]分离筛选到一株产碱性普鲁兰酶活性较高的芽孢杆菌（Bacillus sp.SX-12），此酶最适反应pH值和温度分别为10.0～10.5和55 ℃；在55 ℃反应条件下，酶在pH值6.0～11.0范围内都具有一定的活性。2009年徐金利等[21]从热液口分离到一株嗜热球菌（Thermococcus sp.HJ21），该菌株产生的普鲁兰酶最适作用温度为90 ℃，在80～100 ℃仍保持较高的酶活性，在100 ℃保温2 h，仍有50%以上的残余酶活；该酶最适作用pH值为6.0，在pH值5.0～7.0可以保持较高的酶活性，在pH值6.5时稳定性最好。林杰等[22]对苏云金芽孢杆菌Konkukian亚种的普鲁兰酶编码基因amyX进行鉴定，并在大肠杆菌中成功表达，对重组酶的性质进行了研究，该重组菌培养液的酶活力为2.5 U/mL，对淀粉没有分解能力，属于Ⅰ型普鲁兰酶。

2.2异普鲁兰酶

1972年日本Sakano等[23]报导在Aspergillus niger ATCC 9642中发现此酶，其特异性底物是普鲁兰和潘糖；1996年Aoki等[24]对该酶进行分离提纯和酶学性质的研究：该酶被分为2个有效组分：IPU F1（pI5.0），IPU F2（pI4.9），这两部分的底物特异性、最适pH值、酸碱稳定性和对特定化学试剂的敏感性都是一样的，并且有着同样的N末端氨基酸序列A-V-T-A-D-N-S-Q-L-L；IPU F1的分子量是71 KDa，IPU F2的分子量是69 kDa，IPU F1（15.3%）比IPU F2（12.4%）含有更多的碳水化合物，去糖基化之后这2个组分的分子量又都为59 kDa。1997年Aoki等[25]对该酶基因进行了分子克隆和异源表达，由于IPU的高度糖基化，未得到其晶体；2007年，Mizuno等[26]成功获得了异普鲁兰酶的晶体并对其结构进行研究，其内部结构表明，该酶属于GH49（糖苷水解酶类49家族）。目前，国内暂时未见有对异普鲁兰酶研究的相关报道。

2.3异淀粉酶

1961年，Gunja等[27]报道了酵母的异淀粉酶，它可以使支链淀粉与碘的呈色反应由紫红变成蓝色，该酶可以水解支链淀粉和糖原中的α-1，6-糖苷键，但是不能作用于普鲁兰。随着对异淀粉酶研究的增多，发现假单胞菌、芽孢杆菌等也可以产生异淀粉酶。1970年，Yokobayashi等[28]对假单胞菌Pseudomonas sp.SB-15异淀粉酶进行了纯化，纯酶酶学性质实验结果表明：该酶的分子量是52 kDa，最适反应pH值为5.5～6.0，最适温度为52.5 ℃。1988年，Amemura等[29]对一株假单胞菌属的菌Pseudomonas amyloderamosa sb-15异淀粉酶的基因进行克隆和核苷酸序列测定。Ma等[30]通过基因重组将假单胞菌属的异淀粉酶的基因，在酿酒酵母中成功表达生产异淀粉酶和糖化酶，从而提高该酶对淀粉的转换率，达到95%以上。

我国研究异淀粉酶较晚其相关报导也较少。1993年，王武等[31]研究和讨论了一株短杆菌异淀粉酶的筛选、诱变、产酶条件及部分酶学特性。摇瓶发酵中酶活单位最高可达520 U/mL，酶作用最适pH值为5.0；最适反应温度为55 ℃。2003年，王弋博等[32]报导从土壤中分离筛选到一株产异淀粉酶的地衣芽孢杆菌并对其进行了诱变育种和性质研究，使该酶酶活从3.35 U/mL提高到7.37 U/mL；2005年，夏静等[33]从云南梁河温泉水样中分离筛选到1株产耐热异淀粉酶的菌株，鉴定为栖热菌并研究了产酶条件；2008年，米运宏等[34]将原始菌克雷伯氏菌经诱变处理后筛选分离到高产异淀粉酶的菌株并做了初步研究；2007年，郭宏文等[35]从淀粉厂附近的土壤样品中筛选到一株产偏酸性民淀粉酶的细菌，经初步鉴定为芽孢杆菌；2010年，又对其进行诱变获得高产菌株，酶活力达到230.1 U/mL，并且将该酶进行分离纯化出，对其酶学性质进行了初步研究。在pH值5.0～7.4 范围内酶活力较高，酶反应的最适pH值为5.2；在50～60 ℃范围内酶活力较高，酶反应的最适温度为55 ℃[36]。通过以上学者对异淀粉酶的研究可以看出：目前，国内对异淀粉酶的研究还仅局限于实验室阶段，酶活力较低，达不到能够工业化生产的要求。

2.4新普鲁兰酶

1998年日本Kuriki等[37]首次报道了新普鲁兰酶（来源于Bacillus stearothermophilus TRS40），它可以水解普鲁兰和少部分淀粉。在后续研究中Imanaka[38]等发现新普鲁兰酶不仅可以作用于α-1，4-糖苷键，也可作用于若干寡糖的α-1， 6-糖苷键；1989年测定了该新普鲁兰酶基因的核苷酸序列，该酶由1 764个碱基对、588个氨基酸构成[39]。2003年Hondoh和Kuriki[40]对一株耐热细菌新普鲁兰的三维结构和底物特异性进行了研究。国外的研究多集中于嗜热脂肪芽孢杆菌新普鲁兰酶的研究方面，而目前国内的暂未见到相关研究的报道。

3应用

淀粉脱支酶由于α-1，6-糖苷键的水解作用，可使淀粉完全脱支，在工业上具有广泛的应用。

3.1淀粉工业生产中的应用[41]

高葡糖浆的生产：传统生产方法是采用α-淀粉酶和糖化酶水解淀粉，由于这2种酶都不能水解α-1，6-糖苷键，故淀粉不能彻底被分解；另外，由于糖化酶的作用方式是依次进行的，不能越过α-1，6-糖苷键，所以其酶解速度受到限制，加入脱支酶，可减少反应时间，并且提高产物的纯度。

高麦芽糖浆的生产：麦芽糖是采用α-淀粉酶、β-淀粉酶共同水解淀粉制得的，在糖化时添加脱支酶可将支链淀粉脱支而形成短的直链淀粉片段，有利于β-淀粉酶的作用，减少β-极限糊精的形成，从而提高麦芽糖的含量。普鲁兰酶与α-淀粉酶、β-淀粉酶协同作用，可得到麦芽糖含量为92.4 g/100 g的糖化液。

玉米淀粉制备结晶葡萄糖的生产：糖化工艺是影响葡萄糖转化率、葡萄糖质量以及生产周期的关键。目前，生产中存在的问题之一是玉米淀粉的支链淀粉含量大于70%，而糖化酶只能降解α-1，4-糖苷键，导致葡萄糖转化率不高，从而延长生产周期。王兆军等[42]通过试验优化了玉米淀粉糖化的工艺参数；糖化温度60 ℃，pH值4.5，糖化时间48 h，糖化酶用量250 μ/g淀粉，添加普鲁兰酶0.10 ASPU/g淀粉，从而解决了上述问题。

近年来，随着经济的发展和人民生活水平的提高，人们对淀粉制品的品质提出了越来越高的要求。在一些有特殊作用的改性淀粉的生产中，脱支酶有很大的优势，如利用脱支酶可以作用生产抗消化淀粉、歧化环糊精、缓慢消化淀粉、直链淀粉等。

3.2在啤酒生产中的应用

在啤酒酿造的糖化过程中，要使大麦及其他辅助原料糖化完全，除了麦芽中的酶系外，还添加α-淀粉酶和脱支酶等。如果分解淀粉α-1，6-糖苷键的酶活性不足，淀粉分解就不完全，其结果是可发酵性糖含量低，制成的啤酒发酵度达不到要求。采用脱支酶与α-淀粉酶协同作用，效果较好，其分解产物主要是麦芽糖和少量的麦芽多糖。啤酒外加酶法糖化工艺已在世界范围内被广泛接受，脱支能酶使原辅料中的淀粉分解完全，降低麦芽汁中β-极限糊精含量，增加可发酵性糖的含量，从而大幅度提高发酵度。近年来兴起的干爽啤酒的主要特色是发酵度高，通常发酵度要大于75%，而要获得这样高的发酵度，在糖化阶段就必须要添加普鲁兰酶[42]。

传统的啤酒生产，以麦芽为主料，常用的辅料有大米、玉米、燕麦、大麦、小麦等。啤酒生产所用辅料直接影响啤酒质量和成本，欧洲发达国家在20世纪60年代就开始大量使用各种啤酒专用糖浆代替玉米和大米作辅料。啤酒专用糖浆是以玉米淀粉、大麦等为原料，利用酶制剂制得符合啤酒生产的糖浆。啤酒专用糖浆的构成应尽量接近麦芽汁的成分，这样才能满足啤酒生产的需要，从而使酿造的啤酒在口感、色度及泡沫等方面达到质量要求。因此，啤酒糖浆的生产工艺与普通淀粉糖浆有差异。液化采用高温α-淀粉酶，糖化采用β-淀粉酶，脱支酶、葡萄糖糖化酶等，以提高啤酒糖浆的麦芽糖含量。α-淀粉酶为内切酶，主要水解α-1， 4糖苷键而不能水解α-1，6糖苷键。β-淀粉酶和葡萄糖糖化酶为外切酶。β-淀粉酶虽能从非还原性末端任意水解α-1， 4糖苷键，但不能绕过α-1，6糖苷键，因而留下大量的大分子极限糊精。真菌α-淀粉酶为内切酶，能将麦芽五糖转变葡萄糖，因而增加了葡萄糖的含量。而葡萄糖糖化酶为另一种外切酶，它既能水解α-1，4糖苷键，又能水解α-1，6糖苷键，因而能完全水解淀粉，产物为葡萄糖，但水解速度较慢。脱支酶（普鲁兰酶和异淀粉酶）能水解α-1，6糖苷键产生短链分子。根据酿造要求，将这些酶配合使用，可以生产出适合啤酒酿造的专用糖浆[43]。啤酒专用糖浆不仅可以保证啤酒生产的正常进行并降低生产成本，而且缓解了大麦供应的紧张局面。国际上，美国、日本、非洲及欧洲地区许多国家都采用专用糖浆酿造啤酒，我国部分地区的啤酒厂也进行了这方面的应用，取得了很好的效果。

3.3在饲料工业中的应用[44]

酶有高度的专一性和特异性，而动物种类及其生长阶段不同，动物体内产生的酶种类和数量都不相同。因此，根据动物种类及生长阶段的特点选用合适的饲用酶制剂，才能有效发挥和提高酶制剂的作用效果。动物的幼龄期，消化系统的发育还不完善，消化酶尤其是蛋白酶和淀粉酶分泌还不足，是使用酶制剂较理想的阶段。一般应选用含有多种消化酶，特别是淀粉酶和蛋白酶为主的酶制剂。通常用于饲料的谷物淀粉，以支链淀粉为主，其含量高达80%，直链淀粉含量仅占20%，而目前常用饲用淀粉酶制剂主要为α-淀粉酶、β-淀粉酶和糖化酶，这3种酶不能迅速彻底地水解支链淀粉。因此，添加适量的淀粉脱支酶分解淀粉液化液，可使其转变为直链淀粉，这样更有利于其他淀粉酶的水解过程，提高饲料中谷物淀粉的利用率。

4结语

脱支酶的发现较其他淀粉酶迟，但近年来对它的研究和应用受到学者和企业的广泛重视。脱支酶可使食品质量提高，彻底分解淀粉，降低粮耗，节约成本，减少污染，已成为淀粉酶制剂中一个很有前途的品种，具有广阔的开发和应用前景。然而目前脱支酶中只有普鲁兰酶进行工业化生产，并且国际上普鲁兰酶的工业化生产被丹麦垄断，我国对脱支酶的研究仅局限于实验室研究，酶活较低，工业上应用脱支酶也是依靠进口，成本较高。因此，开发脱支酶对淀粉加工领域具有重要的工业价值。

5参考文献

[1] NISHIMURA S.The liquefaction of starch by the enzyme in yeast autolysate[J].Bull Agr Chem Soc Japan，1928（4）：126.

[2] NISHIMURA S.Amylosynthease[J].J Agr Chem Soc Japan，1930，6（39）：160-167，485-486，978-990.

[3] MINAGAWA T.AmylosyntheaseⅠ[J].J Agr Chem Soc Japan，1932，8（510）：176-183.

[4] MINAGAWA T.Amylosynthease ⅩⅩⅤ[J].J Agr Chem Soc Japan，1935（11）：370-373.

[5] MARUO B，KOBAYASHI T.The enzymic formation and degradation of starch，Ⅰ.Examination of amylosynthease[J].J Agr Chem Soc Japan，1949（23）：115-119.

[6] MARUO B，KOBAYASHI T.The enzymic formation and degradation of starch，Ⅱ.Examination of amylosynthease[J].J Agr Chem Soc Japan，1949（23）：120-123.

[7] MARUO B，KOBAYASHI T.The enzymic formation and degradation of starch，Ⅶ.The relation between amylosynthease and amyloglucosidase[J].J Agr Chem Soc Japan，1951（24）：309-313.

[8] MARUO B，KOBAYASHI T.Enzymic scission of the branch links in amylopectin[J].Nature，1951，167（1038）：606-607.

[9] PURICH D L，ALLISON R D.The enzyme reference-A comprehensive guidebook to enzyme nomenclature，reactions and methods[M].Academic press，2002：487，492，520，605，722.

[10] BENDER H，WALLENFEL S K，Pullulan.Ⅱ.Specific decomposition by a bacterial enzyme[J].Biochem Ⅰ，1961（334）：79-95.

[11] WALLENFEL K，BENDER H.Pullulanase from Aerobacter aerogenes production in a cell-bound state.Purification and properties of enzyme[J].Biochem Biophys Res Commun，1966，22（3）：254-261

[12] TAKASAKI Y.Purificntions enzymatic preparation of β-amylase and pullulanase from Bacillus cereus Var.mycoides[J].Agric Biol Chem，1976（40）：1523-1530.

[13] TAKASAKI Y.Pullulanase-amylase complex-enzyme from Bacillus subtilis TU[J].Agric Biol Chem，1987，51（1）：9-16.

[14] TAKIZAWA N，MUROOKA Y.Cloning of the pullulanase gene overp-roduction of pullulanase in Escherichia coli and Klebsiella aerogenes[J].Appl Environ Microbiol，1985，49（2）：294-298.

[15] 江西食品发酵工业科学研究所.产气气杆菌10016异淀粉酶的研究[J].微生物学报，1976，16（4）：282-290.

[16] 戈苏国，杨寿钧，张树政.产气杆菌茁霉多糖酶的研究.Ⅰ.酶的提纯和性质[J].微生物学报，1980，20（4）：415-420.

[17] 张锡清，尤红棣，程池，等.食品级异淀粉酶的提制技术[J].食品与发酵工业，1990（2）：51-54，59.

[18] MADI E，ANTRANIKIAN G.Identification of a starch degrading anaer-obic thermophile producing thermostable α-amylase and pullulanase[J].Applied Microbiology Biotechnology，1989，30（4）：422-425.

[19] 唐宝英，朱晓慧，刘佳.耐酸耐热普鲁兰酶菌株的筛选及发酵条件的研究[J].微生物学通报，2001，28（1）：39-43.

[20] 马晓军，张晓君，王锐，等.碱性普鲁兰酶产生菌选育和发酵条件的研究[J].西北植物学报，2002，22（4）：883-888.

[21] 徐金利，吕明生，王淑军，等.嗜热古菌Thermococcus sp.HJ21产高温普鲁兰酶条件和酶学性质[J].食品与生物技术学报，2009，28（2）：243-249.

[22] 林杰，沈微，饶志明，等.苏云金芽孢杆菌普鲁兰酶编码基因amyX的鉴定与重组酶性质研究[J].安徽农业科学，2008，36（17）：7155-7156，7161.

[23] SAKANO Y，HIGUCHI M&KOBAYASHI T.Pullulan 4-glucanohydr-olase from Aspergillus niger[J].Arch Biochem Biophys，1972，153（1）：180-187.

[24] AOKI H，YOPI，PADMAJANTI A.Two components of cell-bound isopu-llulanase form Aspergillu niger ATCC9642-Their purification and enzymatic properties[J].BIosci Biotech Biochem1996，60（11）：1795-1798.

[25] AOKI H，YOPI，SAKANO Y.Molecular cloning and heterologous expr-ession of the isopullulanase gene from Aspergillus niger A.T.C.C.9642[J].Biochem J，1997，323（Pt3）：757-764.

[26] MIZUNO M，KOIDE A，YAMAMUR A，et al.Crystal structure of Asper-gillus niger isopullulanase，a member of glycoside hydrolase family 49[J].J Mal Biol，2007（11）：1-11.

[27] GUNJA Z H，MANNER D J，MAUNGK.Studies on carbohydrate-meta-bolizing enzymes.Ⅶ.Yeast isoamylase[J].Biochemical J，1961，81（2）：392-398.

[28] YOKOBAYASHI K，MISAKI A，HARADA H.Purification and pro-perties of Pseudomonas isoamylase[J].Biochim Biophys Acta，1970，212（3）：458-469.

[29] AMEMURA A，CHAKRABORTH R，FUJITA M，etal.Cloning and nucl-eotide sequence of the isoamylase gene from Pseudomonas amylo-deramosa SB-15[J].J Biol Chem，1988，263（5）：9271-9275.

[30] MA Y J，LIN L L，CHIEN H R，etal.Efficient utilization of starch by a recombinant strain of Saccharomyces cerevisiae producing glucoamylase and isoamylase[J].Biotechnol Applied Biochemistry，2000，31（1）：55-59.

[31] 王武，周晓宏.短杆菌异淀粉酶产生菌选育及酶作用性质研究[J].无锡轻工业学院学报，1993，12（3）：197-204.

[32] 王弋博，李博，李三相，等.异淀粉酶产生菌的分离纯化及生长特性[J].青海师范大学学报：自然科学版，2003（1）：82-85.

[33] 夏静，陈朝银，上官俊龙，等.一株产异淀粉酶栖热菌的生长和产酶初步研究[J].微生物学杂志，2005，25（5）：107-109.

[34] 米运宏，邓梁华，黄静，等.微波与NTG 复合诱变育种Klebsiella高产异淀粉酶突变株[J].中国食品添加剂，2008（2）：96-99.

[35] 郭宏文，冮洁，田明，等.酸性异淀粉酶产生菌的诱变育种[J].高师理科学刊，2007，27（2）：107-109.

[36] 郭宏文，冮洁，邹东恢，等.酸性异淀粉酶产生菌的筛选及鉴定[J].中国酿造，2007（7）：15-18.

[37] KURIKI T，OKAT S，IMANAKA T.New-type of pullulanase from Bacillus stearothermophilus and molecular cloning and expression of the gene in Bacillus subtilis[J].J BBacteriol，1988，170（4）：1554-1559.

[38] IMANAKA T，KURIKI T.Pattern of action of Bacillus-stearothermo-philus neopullulanase on pullulan[J].J Bacteriol，1989，171（1）：369-374.

[39] KURIKI T，IMANAKA T.Nucleotide sequence of neopullulanase gene from Bacillus stearothermophilus[J].J Gen Microbiol，1989，135（6）：1521-1528.

[40] HONDOH H，KURIKI T.Three-dimensional structure and substrate binding of Bacillus stearothermophilus neopullulanase[J].J Mol Biol，2003，326（1）：177-188.

[41] 周念波，孙杰，王晶.普鲁兰酶在食品工业中的应用[J].食品工程，2008，6（2）：18-20.

[42] 王兆升，董海洲.玉米淀粉制备结晶葡萄糖中糖化影响因素的研究[J].农产品加工·学刊，2006（2）：1-10.

[43] 邹东恢，侯美玉.啤酒专用糖浆的研究与应用[J].食品工业，2005（4）：9-11.

[44] 王晓燕，廖昌珑，杨云娟.异淀粉酶在饲料工业中的应用价值[J].饲料添加剂，2010（4）：15-17.