ERK1／2在大鼠心肌缺血预处理中的作用

马彩云，李远征，杜凤和

1986年 Murry等［1］首次提出了缺血预处理 （ischemic preconditioning，IPC）的概念：预先反复短暂缺血再灌注（ischemia／reperfusion，I／R）可以提高心肌组织对随后较长时间缺血的耐受性。IPC是迄今为止对心肌保护作用最强的机体内源性保护机制。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）家族在细胞分化、发育、存活及死亡等生理过程中发挥着重要的作用。细胞外信号调节的蛋白激酶（extracellular signal regulated protein kinases，ERK）是 MAPK家族重要成员之一。ERK转导通路不仅涉及心肌细胞的信号转导、生长等生理过程，而且与心肌细胞的肥厚和凋亡等病理过程密切相关。ERK在IPC中的变化及意义仍存在争议。本研究旨在观察IPC对大鼠缺血再灌注心律失常和心功能的影响以及ERK1／2在IPC中的作用，从而探讨缺血预处理的保护机制。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠16只，体重150g～180g，由首都医科大学实验动物部提供；抗－磷酸化 MAPK（Thr202／Thy204）购自美国Promega公司；羊抗兔IgG抗体－辣根过氧化物酶标记购自北京中山公司；Western－Blotting发光试剂盒购自美国Santa Cruz。

1.2 方法 所有动物均为自由饮水、自由摄食。8周后，戊巴比妥钠（45mg／kg）腹腔注射麻醉。气管插管连接动物人工呼吸机。结扎和松开冠状动脉左前降支复制心肌I／R模型；采用缺血5min／再灌注5min两次造成IPC。用四导生理记录仪持续监测标准肢体导联（Ⅱ）导的心电图，并通过高速数据采集卡输入计算机。参考Cutis和Raringgervoa等［2，3］的标准对心律失常进行评分。0分：无心律失常或仅有室性早搏（＜5次）；1分：仅有室性早搏（≥5次）；2分：仅有一阵室性心动过速（＜60 s）；3分：一阵心动过速（≥60s）或多阵心动过速（累积＜60s）；4分：多阵心动过速（累积≥60s）；5分：出现室颤（非不可逆性）；6分：出现不可逆性室颤或死亡。实验结束后，迅速取出心脏置液氮中，采用Western－blotting分析方法检测心肌中ERK1／2的磷酸化表达。

1.3 实验分组 IPC组：大鼠手术后经缺血5min／再灌注5 min两轮后，给予缺血60min／再灌注30min处理后取心脏；I／R组：大鼠经手术后观察20min，然后给予缺血60min／再灌注30min处理后取心脏。

1.4 统计学处理 采用SPSS14.0统计软件包处理。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验。

2 结 果

缺血60min及再灌注期间，IPC组心律失常评分显著低于I／R组（P＜0.01）；IPC组大鼠心肌ERK1／2磷酸化表达明显高于I／R组。详见表1和图1。

表1 两组大鼠缺血／再灌注期心律失常评分及ERK1、ERK2的磷酸化表达（x±s）

3 讨 论

图1 大鼠心肌ERK1／2的磷酸化表达

本实验以在体大鼠模型研究IPC现象，发现在短阵IPC后，再给予缺血再灌注处理时，IPC组大鼠缺血再灌期的心律失常评分较IR组显著降低，说明IPC能够减轻大鼠缺血再灌注心律失常的严重程度，这与既往的研究结果一致［4］。近年来，以受体激活为起点，以细胞内信号转导为主线构成IPC保护机制研究的重点。MAPK是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者。ERK是MAPK家族成员之一，至少包含ERK1和ERK2两个亚型。它的信号传递途径是涉及调剂细胞生长、发育和分裂的信号网络中心，其基本的信号传递步骤是：Ras－Raf－MEK－ERK。目前多数研究表明ERK1／2的激活参与IPC的保护作用。Schaper等的研究发现，用ERK的抑制剂PD098059能够消除猪IPC诱导的早期保护作用，而预处理期间ERK1和ERK2的活性升高，表明ERK参与IPC的心脏早期保护作用［5］。Choid等［6］研究表明 ERK1／2激活可能是大鼠海马神经元IPC保护作用的机制之一。近年我国也有学者研究指出ERK－MAPK信号转导通路在IPC过程中能够通过抑制Rho－激酶的活性从而减弱大鼠缺血／再灌注引起的心肌细胞凋亡［7］。这与本实验研究结果一致。也有研究不支持ERK参与IPC的保护作用。Kim等的研究表明IPC引起的早期保护中，ERK1的激活是暂时的，并不参与IPC引起的心肌梗死面积的减少［8］。而Namura等的［9］研究结果显示ERK介导了神经元的死亡。这可能与动物的种属和实验模型有关。

总之，本研究结果表明IPC组大鼠心肌ERK1／2表达明显高于IR组，提示ERK1／2激活可能是IPC心肌保护作用的产生机制之一。

［1］ Murry CE，Jennings RB，Reimer KA.Preconditioning with ischemia：A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium［J］.Circulation，1986，74（5）：1124－1136.

［2］ Curtis MJ.Model for the study of arrhythmias in the myocardial ischemia and infarction：The use of the rat［J］.J Mol Cell Cardiol，1987，19：399－419.

［3］ Ravingerova T.Intermediate and prolonged ischemia in the isolated crystalloid perfused rat heart：Relation between susceptibility to arrhythmias and degree of ultrastructural injury［J］.J Mol Cell Cardiol，1995，27：1937－1951.

［4］ 马彩云，张立克，杜凤和，等.细胞外信号调节的蛋白激酶对糖尿病大鼠心肌缺血预处理的影响［J］.中国病理生理学杂志，2005，21（1）：68－71.

［5］ Strohm C，Barancil M，Brahl M，et al.Inhibition of ER－Kinase cascade by PD 098059and U 0126counteracta ischemic preconditioning in pig myocardium［J］.Cardiovascular Research，2000，36：218－229.

［6］ Choid JS，Kim HY，Cha JH，et al.Ischemic preconditioning－induced activation of ERK1／2in the rat hippocampus［J］.Neurosci Lett，2006，409（3）：187－191.

［7］ Zhang J，Bian HJ，Li XX，et al.ERK－MAPK signaling opposes rho－kinase to reduce cardiomyocyte apoptosis in heart ischemic preconditioning［J］.Molecular Medicine，2010，16（7－8）：307－315.

［8］ Ryan M，Fryer AK，Hsu GJ，et al.ERK and P38MAP kinase activation are components of opioid－induced delayed cardioprotection［J］.Basic Research in Cardiology，2001，96（2）：136－142.

［9］ Namura S，Lihara K，Takami S，et al.Intravenous administration of MEK inhibitor U0126affords brain protection against forebrain ischemia and focal cerebral ischemia［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，12：3487－3491.