WWOX蛋白在胰腺癌组织中的表达及其临床意义

张 杰 王 赟 陈小希

（1十堰市人民医院内分泌科 湖北442000；2中国人民解放军 95825部队医院 湖北 432111；3湖北省地质职工医院 武汉430072）

胰腺癌发病隐匿，恶性程度高，早期诊断困难，并且对各种辅助治疗敏感性不高［1］，生存率低，是预后差的恶性肿瘤之一［2］。胰腺癌发病率逐年上升，已成为胃肠道恶性肿瘤中继结、直肠癌后第4位致患者死亡的原因。因此，对胰腺癌侵袭、转移的研究，对于提高胰腺癌的诊断和治疗有极其重要的意义。

包含 WW 域的氧化还原酶（WW domain－containing oxidoreductase，WWOX）基因是一个跨越了染色体脆性位点FRA16D的抑癌基因，内、外源性多种因素造成FRA16D断裂，使WWOX基因发生基因组重排而失活，导致WWOX基因在多种肿瘤细胞中表达降低或缺失［3－4］。

本文通过应用免疫组织化学方法和图像分析技术检测胰腺癌及胰腺炎组织中WWOX蛋白的表达水平，探讨WWOX蛋白在胰腺癌发生、发展过程中的作用机制，为临床上治疗胰腺癌提供理论依据。

材料和方法

1.材料来源

人胰腺癌芯片4张由桂林泛谱生物技术有限公司构建，15×10点阵，每点直径1.1mm，4μm厚，其中包括70例胰腺癌组织和5例胰腺炎，双芯布阵。所有组织来自临床外科手术切除标本，经10%中性缓冲甲醛固定24h。

2.主要试剂

即用型鼠抗人WWOX单克隆抗体（购于北京中杉生物技术有限公司）；超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒（购于福州迈新公司）；DAB显色试剂盒及多聚赖氨酸（购于北京中杉生物技术有限公司）。

3.方法

3.1 常规脱水、透明、石蜡包埋、切片及HE染色

3.2 免疫组织化学SP法检测WWOX相关抗原 具体步骤：（1）4μm组织切片常规脱蜡入水；（2）抗原修复（柠檬酸缓冲液微波抗原修复法）；（3）滴加3%过氧化氢，37℃湿盒孵育10min以抑制内源性过氧化物酶活性；（4）正常羊血清37℃湿盒孵育10min以减少非特异性背景；（5）分别滴加一抗；（6）滴加链霉素抗生物素蛋白－过氧化物复合物37℃湿盒孵育；（7）滴加新鲜配置的DAB显色液显色；（8）苏木素复染；（9）梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片并镜检；（10）用PBS代替一抗作为阴性对照组，购买的阳性片作为WWOX的阳性对照组。

4.免疫组织化学结果判断

（1）WWOX以胞质出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。

（2）采用HPIAS－1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对WWOX的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。（阳性面积率＝单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100%）

5.统计学处理

数据以均数±标准差表示，用SPSS11.5软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK（q）检验，检验水准α为0.05。

结 果

1.WWOX的表达

胰腺癌胞质内可见少量的棕黄色颗粒，WWOX表达弱（图1）；胰腺炎胞质内可见较多的棕黄色颗粒，WWOX表达强（图2）。

2.图像分析结果显示

胰腺癌组 WWOX的平均光密度为0.0854±0.0024，胰腺炎组 WWOX的平均光密度为0.2105±0.0083；胰腺癌组WWOX的阳性面积率为0.0862±0.0029，胰腺炎组WWOX的阳性面积率为0.2280±0.0079。胰腺癌组织中WWOX的表达明显低于胰腺炎组织，差异具有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

图1 WWOX的表达 胰腺癌腺泡细胞胞质内可见少量的棕黄色颗粒，WWOX表达弱，S－P×400Fig.1 The expression of WWOX There were few brown particles in the cytoplasm of pancreatic cancinoma acinar cell，which showed WWOX expressed weakly.S－P×400

图2 WWOX的表达 胰腺炎腺泡细胞胞质内可见较多的棕黄色颗粒，WWOX表达强，S－P×400Fig.2 The expression of WWOX There were plenty of brown particles in the cytoplasm of pancreatitis acinar cell，which showed WWOX expressed strongly.S－P×400

表1 胰腺癌和胰腺炎组织中WWOX表达的平均光密度和阳性面积率（±s）Table1 The average optical density and the rate of WWOX positive area in Pancreatic cancer and pancratitis（±s）

表1 胰腺癌和胰腺炎组织中WWOX表达的平均光密度和阳性面积率（±s）Table1 The average optical density and the rate of WWOX positive area in Pancreatic cancer and pancratitis（±s）

（Comparison between Pancreatic cancer and pancreatitis）▲与胰腺炎组比较，P＜0.05

组别Groups例数N 平均光密度Average Optical Density 阳性面积率Rate of Positive胰腺癌Pancreatic cancer 70 0.0854±0.0024▲ 0.0862±0.0029▲胰腺炎pancreatitis 5 0.2105±0.0083 0.2280±0.0079

讨 论

胰腺原发性肿瘤主要包括三种组织来源，即外分泌、内分泌和间叶组织。胰腺外分泌部肿瘤占了胰腺肿瘤的90%以上，其中80%来源于胰腺导管上皮。胰腺癌的发病率近年来呈上升趋势，2002年统计胰腺癌死亡率位于我国10种恶性肿瘤的第6位，美国位于第4位。由于胰腺解剖位置隐匿，早期症状不明显，而且缺乏敏感性高的早期诊断标志物，大部分患者就诊时已为中晚期，失去了最佳的手术时机。胰腺癌同时具有高度恶性的生物学行为，临床经过凶险生存率很低。

随着科技进步和医学发展，人类战胜了多种疾病的挑战，但恶性肿瘤仍然严重威胁着人们的生命和健康。尽管目前的手术配合放化疗的治疗方式在一定程度上帮助一部分患者摆脱了肿瘤疾病的困扰，但恶性肿瘤的发病率和死亡率仍在逐年增高。因此，从根本上降低肿瘤的发生，延缓其发展速度，同时提高患者自身的抗肿瘤能力就成为一个丞待解决的问题。

恶性肿瘤属于一种基因病，在其发生发展过程中涉及多种基因的改变，其中抑癌基因的缺失或失活发挥着重要作用。人为的引入或激活抑癌基因，是从根本上防治恶性肿瘤的基因疗法，正成为一种极具前景的生物学治疗手段受到各国的重视，并为此展开了广泛研究。

包含 WW域的氧化还原酶（WW domain－containing oxidoreductase，WWOX）基因是2000年新发现的在普通型脆性位点FRA16D上的候选抑癌基因，跨越了基因组内STS markers D16s518和D16s516的一个＞100万bp的区域内、外源性多种因素造成 FRA16D 断裂［5－7］，使 WWOX 基因发生基因组重排而失活，导致WWOX基因在多种肿瘤细胞中表达降低或缺失。某些肿瘤细胞因为WWOX基因的缺乏而不能发生凋亡，稳定表达 WWOX基因的肿瘤细胞在裸鼠体内的成瘤性下降。这些发现提示WWOX基因能够抑制肿瘤细胞生长，因此有人认为 WWOX基因是一种抑癌基因［8－10］。尽管仍有人对这一结论提出质疑，但是 WWOX的抗肿瘤作用已经被多数学者认同。揭示WWOX基因的抑癌机制、使其更好的发挥抑癌作用，对以 WWOX基因为靶点的肿瘤基因治疗有更加现实的意义。

WWOX蛋白表达异常已在多种肿瘤上有发现［11－14］，而在胰腺癌中的表达国内外少见报道，我们应用免疫组化研究 WWOX在胰腺癌中的表达，并探讨与其生物学行为及预后关系。

本实验采用免疫组织化学方法对WWOX基因在胰腺癌组织中的表达进行了检测。实验结果显示：胰腺癌组织中WWOX蛋白呈低表达，胰腺炎组织中，WWOX蛋白呈高表达。在胰腺癌中WWOX蛋白的含量明显低于胰腺炎组织 （P＜0.05），提示WWOX蛋白可能参与调控了胰腺癌的发生、发展。

［1］Hawes RH，Xiong Q，W axman I，et al.A multispecialty approach to the diagnosis and management of pancreatic cancer.Am J Gastroenterol，2000，95：17－31

［2］Neoptolemos JP，Dunn JA，Stocken DD，et al.A djuvant chemo radio therapy and chemo therapy in respecTablepancreatic cancer：a random ised contro lled trial.L ancet，2001，358：1576－1585

［3］Duax WL and Ghosh D.Structure and function of steroid dehydrogenasesInvolved in hypertension，fertility，andcancer.Steriods.1997，62（1）：95－100

［4］Lin B，White JT and Ferguson C，et al.Prostate short－chain dehydroge－nase reductase1（PSDR1）：a new member of the short－chain steroid dehydrogenase/reductase family highly expressed in normal and neoplastic prostate epithelium.Cancer Res.2001，61（4）：1611－1618

［5］Kallberg Y，Oppermann U and Jrnvall H.Short－chain dehydrogenase/reductase（SDR）RELATIONSHIPS：a large family with eight clusters common to human，animal，and plantgenomes.Protein Sci.2002，11（3）：636－641

［6］Bednarek AK，Keck－Waggoner CL ，Daniel RL.WWOX，the FRA16Dgene，behaves as a suppressor of tumor growth.Cancer Res.2001，61（3）：8068－8073

［7］Chang NS，Pratt N and Heath J.Hyaluronidase induction of a WW domain－containing oxidoreductase that enhances tumor necrosis factor cytotoxicity.J Biol Chem.2001，276（6）：3361－3370

［8］Nunez MI，Ludes－Meyers J，Aldaz CM.WWOX protein expression in normal human tissues.J Mol Histol.2006，37（3－4）：115－125

［9］Park SW，Ludes－Meyers J，Zimonjic DB，et al.Frequent downregulation and loss of WWOX gene expression in human hepatocellular carcinoma.Br J Cancer.2004，91（4）：753－759

［10］Nunez MI，Rosen DG，Ludes－Meyers JH，et al.WWOX protein expression varies among ovarian carcinoma histotypes and correlates with less favorable outcome.BMC Cancer.2005，5（5）：64

［11］Fabbri M，Iliopoulos D，Trapasso F，et al.WWOX gene restoration prevents lung cancer growth in vitro and in vivo.Proc Natl Acad Sci U S A.2005，102（8）：15611－15616

［12］Watson JE，Doggett NA and Albertson DG.Integration of high－resolution array comparative genomic hybridization analysis of chromosome 16q with expression array data refines common regions of loss at 16q23－qter and identifies underlying candidate tumor suppressor genes in prostate cancer.Oncogene.2004，23（19）：3487－3494

［13］Yendamuri S，Kuroki T and Trapasso F.WW domain containing oxidoreductase gene expression is altered in non－small cell lung cancer.Cancer Res.2003，63（21）：878－881

［14］Ishii H，Vecchione A and Furukawa Y.Expression of FRA16D/WWOX and FRA3B/FHIT genes in hematopoietic malignancies.Mol Cancer Res.2003，1（3）：940－947