c－Met在人乳腺癌组织中的表达及其与明胶酶的关系

陈婷婷 吴正升 王 弦 虞红珍 孟 刚

（安徽医科大学病理学教研室，合肥 230032）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，肿瘤的侵袭性生长、转移和复发是其难以根治和导致乳腺癌患者死亡的主要原因。因此，理解乳腺癌侵袭转移背后的分子机制，发掘有效的肿瘤侵袭转移标志物，对判定患者的预后、及时治疗，从而提高患者的疗效和预后有着十分重要的意义。c－Met基因是编码肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）受体蛋白的原癌基因，广泛存在于包括肿瘤细胞在内的多种上皮细胞，其通过与HGF结合，而在肿瘤细胞的播散、侵袭、迁移及转移中发挥着重要作用。明胶酶（MMP－2，－9）是基质金属蛋白酶（metrix metalloproteinases，MMPs）家族重要成员，能够特异性降解基底膜的主要成分IV型胶原和细胞外基质，从而在肿瘤的侵袭转移过程中发挥十分重要的作用。目前，关于c－Met与明胶酶在人乳腺癌侵袭转移过程中的关系似未见报道，两者之间是否相互作用尚不明朗。本研究首先利用免疫组织化学方法检测人乳腺癌组织c－Met的表达及其与明胶酶表达的相关性，然后通过体外实验和siRNA干扰技术，分析两者之间的关系，力图探讨c－Met在人乳腺癌侵袭转移过程中可能的角色及其分子机制。

材料和方法

1.材料

收集安徽医科大学第一附属医院乳腺癌病例86例乳腺癌组织。所有标本均以4%甲醛固定，石蜡包埋，常规做苏木精－伊红（HE）染色，组织病理学确诊。所有病例以3μm厚度连续切片，敷贴于10%多聚赖氨酸预先处理的载玻片上，备用。人乳腺癌细胞株 MDA－MB－231购自美国ATCC细胞库。

2.试剂

兔抗人c－Met多克隆抗体均购于Santa Cruz公司，beta－actin单克隆抗体购于Neomark公司产品。通用型两步法免疫组织化学试剂盒及DAB显色剂均购于福州迈新公司。南美胎牛血清和L15培养基均为Gibco公司产品。Lipofectamine 2000为Invitrogen公司产品。RIPA细胞裂解蛋白提取试剂、BCA－100法蛋白质定量测定试剂盒为上海申能博彩生物科技公司产品。特异性c－Met siRNA购自上海吉玛生物技术公司，序列为5＇－GCCCAACUACAGAAAUGGUTT－3＇ （sense） and 5＇－ACCAUUUCUGUAGUUGGGCTT－3＇（antisense）。

3.方法

3.1 免疫组织化学两步法染色

切片经柠檬酸钠缓冲液加热抗原修复，DAB显色，苏木素复染。具体操作按说明书染色步骤进行。以PBS缓冲液代替一抗作阴性对照，用已知阳性切片作为阳性对照。

3.2 细胞培养

MDA－MB－231细胞应用L15培养基（含10%胎牛血清，但不添加抗生素），置于含5%CO2，37℃的细胞培养箱中培养。

3.3 细胞的siRNA转染

3.3.1 细胞准备

MDA－MB－231细胞在转染前一天，分细胞至6孔板，每孔细胞数为1×106个/孔，每孔中加入不加抗生素的培养基1.5ml，使转染时的细胞密度能够达到30%－50%。

3.3.2 转染

用前轻轻摇匀转染试剂Lipo，然后在不含血清的培养基250μl中稀释3μl的转染试剂Lipofectamine至1.5ml的EP管中。轻轻混和且在室温孵育5min。在另一个1.5ml的EP管中，在不含血清的培养基250μl中稀释siRNA 50nmol，轻轻混和。经过5min的室温孵育后，将稀释的siRNA和稀释的Lipofectamine轻轻混和，室温孵育20min以形成FAM－siRNA－Lipo混和物。将siRNA－Lipo混和液均匀滴入每个含有细胞及培养液的孔中。轻轻左右、上下摇晃孔板，使混和。在含5%CO2，37℃的细胞培养箱中培养。在培养48h收集细胞，RIPA法提取总蛋白，－80℃冰箱保存备用。

3.3.3 实验分组

阴性siRNA对照组和c－Met siRNA实验组，每组重复3孔。

3.4 Western blotting（SDS－PAGE电泳）

检测转染细胞中c－Met蛋白表达水平，以betaactin为内参照。c－Met一抗浓度为1∶1000，二抗浓度为1∶10000，电泳100V 恒压，电转100V，100min。

4.免疫组织化学结果判定

c－Met蛋白以细胞浆出现明显的黄色或棕黄色颗粒视为阳性着色，按Graveel等［1］评分标准进行半定量分析，大于等于10%的细胞染色视为阳性表达。ER、PR阳性定位于细胞核，出现棕黄色颗粒，大于等于10%的细胞染色视为阳性表达。C－erbB－2以细胞膜出现棕黄色颗粒为判断标准，细胞膜未着色或10%的着色为（﹣），＞10%细胞呈微弱且不完整着色为（＋），＞10%细胞呈弱－中等强度完全着色为（＋＋），＞10%细胞呈强的完全着色为（＋＋＋）。

5.统计学处理

采用SPSS（10.0for window）软件进行统计学处理。样本率之间比较采用χ2检验，两变量间的相关分析采用Spearman等级相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.c－Met、MMP－2和MMP－9蛋白的表达和分布

c－Met、MMP－2和MMP－9蛋白阳性信号均呈黄色或棕黄色颗粒状，主要定位于细胞浆，三者在乳腺癌细胞中染色较强，分布呈异质性，间质成纤维细胞和血管内皮细胞也可见少许表达。c－Met、MMP－2和MMP－9蛋白表达情况如图（图1－3）。86例乳腺癌组织中，c－Met、MMP－2和MMP－9蛋白阳性率分别为58.1%、69.8%和62.8%。

图1 乳腺癌c－Met蛋白阳性表达（免疫组化两步法×400）Fig.1 The positive expression of c－Met protein in breast cancer（immuno histochemical technique of two steps×400）

图2.乳腺癌MMP－2蛋白阳性表达（免疫组化两步法×400）Fig.2 The positive expression of MMP－2protein in breast cancer（immuno histochemical technique of two steps×400）

图3.乳腺癌MMP－9蛋白阳性表达（免疫组化两步法×400）Fig.3 The positive expression of MMP－9protein in breast cancer（immuno histochemical technique of two steps×400）

2.c－Met蛋白表达与乳腺癌患者临床病理特征和预后的关系

由表1所示：乳腺癌组织c－Met蛋白表达与肿瘤的淋巴结转移和临床分期均呈显著正相关（P＜0.01），而与患者年龄、性别、肿瘤大小、组织学分级、雌孕激素和c－erbB－2表达均无显著相关性（P＞0.05）。我们进一步分析c－Met表达与乳腺癌患者预后关系：采用Kaplan－Meier曲线法和Log－rank检验对乳腺癌c－Met表达与患者五年总生存期（OS）和无复发生存期（RFS）关系进行单因素生存分析：c－Met蛋白阳性患者OS显著低于阴性患者（52.8月和60.5月，P＝0.018），并且c－Met蛋白阳性患者RFS也显著低于阴性患者（44.6月和56.0月，P＝0.024）。

3.乳腺癌c－Met与 MMP－2及MMP－9的关系

我们采用了Spearman相关性分析检测乳腺癌组织中c－Met与 MMP－2及MMP－9的关系。相关性分析显示：乳腺癌c－Met和MMP－2及MMP－9表达均呈显著正相关（r＝0.314和0.322，均P＜0.01）。同时，我们通过体外实验结合siRNA技术检测了乳腺癌细胞中c－Met与 MMP－2及MMP－9的关系。Western blot结果显示转染了c－Met siRNA的乳腺癌 MDA－MB－231细胞的 MMP－2和MMP－9表达量较对照组明显下调（图4）。

图4 western blot法检测MDA－MB－231细胞实验组和对照组c－Met、MMP－2和MMP－9蛋白表达Figure 4.The expression of c－Met，MMP－2and MMP－9in MDA－MB－231cells between experimental group and control group by western blot assay

表1 c－Met蛋白在乳腺癌组织中的表达及与临床病理参数的关系Table1 Association of c－Met expression withclinicopathologic parameters from breast cancer patients

讨 论

恶性肿瘤的侵袭转移是一个复杂的多阶梯瀑布进程，经过肿瘤细胞间的粘附力减少、肿瘤细胞与基底膜的紧密附着、细胞外基质的降解以及肿瘤细胞的迁移等一系列过程，最终使得肿瘤细胞从原发部位游走，在继发处形成转移灶。在这些过程中肿瘤细胞迁移能力的增强是重要的一个环节。

c－Met原癌基因位于人类7号染色体长臂（7q31），主要存在于上皮细胞的胞膜和胞浆中，是受体酪氨酸蛋白激酶家族中的成员，也是肝细胞生长因子（HGF）的单一受体。HGF具有很强的促进有丝分裂的作用，通过作用于c－Met受体可以诱导上皮细胞和成纤维细胞发生细胞离散和迁移。研究发现，c－Met和HGF信号传导通路对恶性肿瘤组织的许多生物学行为产生影响，特别是能够促进肿瘤细胞的局部浸润和远处转移［3，4］。在乳腺癌研究中，Lindemann等［5］使用免疫组织化学技术检测了39例乳腺导管原位癌的c－Met表达，发现癌组织c－Met表达显著高于癌旁正常乳腺组织；Garcia等［6］大样本检测了930乳腺癌c－Met蛋白表达，发现c－Met过表达与乳腺癌患者生存期呈显著负相关；国内王承正［7］等研究也发现，乳腺癌c－Met蛋白表达与肿瘤临床分期和淋巴结转移均呈正相关。本研究发现：乳腺癌组织c－Met蛋白表达与肿瘤的淋巴结转移和临床分期均呈显著正相关，而与患者的总生存期和无复发生存期均呈负相关，结果与文献报道一致，提示c－Met在乳腺癌发生和发展过程中发挥了重要作用。

MMP－2和MMP－9是明胶酶的两个成员，由于它们能够特异性降解基底膜和细胞外基质，从而在乳腺癌的侵袭转移过程了直接发挥了的重要作用［8，9］。鉴于c－Met也参与乳腺癌细胞侵袭转移的过程，因此，我们推测MMP－2和MMP－9可能是c－Met下游的基因，即c－Met可能通过调控MMP－2和MMP－9的表达发挥其促进乳腺癌侵袭转移的作用。为此，我们同时也检测了乳腺癌组织中 MMP－2和MMP－9的表达。通过相关性分析，我们发现乳腺癌c－Met蛋白表达与MMP－2和MMP－9均呈显著正相关，提示三者之间可能关系密切。进一步，我们使用特异性靶向c－Met基因的siRNA在体外转染乳腺癌细胞，发现外源性下调乳腺癌细胞c－Met表达后，MMP－2和MMP－9的表达也相应下调，结果证实了乳腺癌组织中的结果。目前关于乳腺癌c－Met与 MMP－2和MMP－9关系的研究似未见报道。在其它肿瘤中，Naka等［10］使用免疫组化技术检测了脊索瘤中c－Met和MMP－2的表达，发现两者呈正相关。Zhou等［11］对人卵巢癌细胞株进行体外研究发现，MMP－9参与了HGF/c－Met介导的肿瘤细胞侵袭和迁移的过程。这些研究结果我们的结果提示c－Met可能参与了乳腺癌细胞MMP－2和MMP－9的调控通路。

综上所述，我们研究发现c－Met与乳腺癌局部侵袭和转移关系密切，是辅助判断乳腺癌患者预后的标志物之一。并且c－Met可能是通过调控MMP－2和MMP－9表达参与了乳腺癌细胞的侵袭和转移。

［1］Graveel CR，DeGroot JD，Su Y，et al.Met induces diverse mammary carcinomas in mice and is associated with human basal breast cancer.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106：12909－12914

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［5］Lindemann K，Resau J，Nährig J，et al.Differential expression of c－Met，its ligand HGF/SF and HER2/neu in DCIS and adjacent normal breast tissue.Histopathology，2007，51：54－62

［6］Garcia S，Dales JP，Charafe－Jauffret E，et al.Overexpression of c－Met and of the transducers PI3K，FAK and JAK in breast carcinomas correlates with shorter survival and neoangiogenesis.Int J Oncol，2007，31：49－58

［7］王承正，昊军召，毛书明，等.在乳腺癌组织中的表达及临床意义.医学论坛杂志，2009，29：25－27

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