银脉凤尾蕨和阔叶鳞盖蕨对干旱胁迫反应的比 较 研 究*

马存旺

(楚雄市紫溪镇前进中学，云南 楚雄 675000)

前言

水分是制约植物生长的主要环境因子，特别是在滇中地区，水资源数量有限，时空分布极不均匀，从而极大地增加了观赏蕨类植物引种驯化、园林绿化和管理的难度。目前普遍认为，植物在逆境下如干旱会引起膜伤害和膜透性的增加及生物自由基的累积，而植物体内一系列的抗氧化酶类和小分子物质以清除这些活性氧自由基，即为植物对不良环境作出的适应性反应［1，2］。已经在很多植物中发现，水分亏缺时，因自由基产生过多，或由于抗氧化防御系统作用减弱，体内自由基不能被完全清除而造成自由基的累积，进而会危害植物［3］。

国内外学者对作物的抗旱 (节水)性及其鉴定指标进行了大量的研究［4～7］澳大利亚在作物蒸腾、水分利用率和收获指数等方面的研究取得了较大进展，但对蕨类植物的抗旱性报道及其少见。因此，本试验旨在研究自然干旱胁迫条件下银脉凤尾蕨和阔叶鳞盖蕨的生理生化指标变化，进而比较其抗旱性差异，为其引种栽培提供理论依据;深入了解植物抗旱特性，探讨植物可能的抗旱机理，为蕨类植物的抗旱生理研究打下坚实的基础。

1.材料与方法

1.1 试验材料

材料采自楚雄师范学院温室，经徐成东教授鉴定，采后种于花盆成活稳定后备用。其中，银脉凤尾蕨银脉凤尾蕨Pteris ensiformis Burm.f.var.victoriae Hort为观赏栽培种，阔叶鳞盖蕨Microlepia platyphylla(D.Don)J.Sm.为野生引种栽培。

1.2 试验仪器、器材及试剂

仪器:722s型分光光度计，HH－S2s型恒温水浴锅，电子天平，离心机，烘箱，酸式滴定管等。

试剂:冰醋酸，茚三酮，磷酸，磺基水杨酸，甲苯，标准脯氨酸，丙酮，浓盐酸，髙锰酸钾，草酸，双氧水，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，碳酸钙，蒸馏水。

1.3 实验材料处理方法

将实验材料种植于相同条件下同样大小的花盆中，分别各种5盆，在相同条件下培育生长，待长势稳定后才能对其进行相应的处理。每隔3天取材一次测定指标并且记录数据，一般共测五次。

1.4 生理指标测定方法

1.4.1 脯氨酸标准曲线的制作

标准溶液的配制:(1)标准液的配制 准确称取25mg恒重的脯氨酸于250ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，得到浓度为100ug/ml的脯氨酸标准溶液。

(2)系列脯氨酸浓度的配制 用移液管分别吸取上述配制的脯氨酸标准溶液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml于6个50ml容量瓶中，并用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。得浓度分别为1、2、3、4、5、6μg/ml的脯氨酸标准溶液。

标准曲线绘制:(1)取2.0ml不同浓度的脯氨酸标准溶液于6支试管中，加2ml冰乙酸和2ml酸性茚三酮液，于沸水浴中加热30min。

(2)取出冷却后向各管加入4ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层，以甲苯液为对照，在波长520nm下比色测定。

(3)葡萄糖标准溶液的浓度与吸光度如表1，以脯氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，如图1。其线性回归方程为y=0.05934x+0.01147(R=0.99771)。

图1 脯氨酸标准曲线Fig 1 Standard curve of proline

表1 脯氨酸标准溶液的浓度与吸光度Table 1 Concentration and absorbance of proline standard solution

1.4.2 叶片含水量测定(RWC)

采用自然含水量法［8］测定叶片含水量。(1)称量瓶的恒重:将洗净的两个称量瓶编号，放在105℃恒温烘箱中，烘2h左右，用坩埚钳取出放入干燥器中冷却至室温后，在电子天平上称重，再于烘箱中烘2h，同样于干燥器中冷却称重，如此重复2次 (2次称重的误差不得超过0.002g)，求得平均值m1，将称量瓶放入干燥器中待用。

(2)将待测植物叶片从植株上取下后迅速剪成小块，装入已知的称量瓶中盖好，在分析天平上准确称取质量，得瓶与鲜样品总质量m2，然后于105℃烘箱中干燥4～6h(注意要打开称量瓶盖子)。取出称量瓶，待其温度降至60～70℃后用坩埚钳将称量瓶盖子盖上，放在干燥器中冷却至室温，再用电子天平称重，然后再放到烘箱中烘2h，在干燥器中冷却至室温，再称重。这样重复几次，直至恒重为止。称得质量是瓶与干样品总质量m3。烘时注意防止植物材料焦化。如系幼嫩组织，可先用100～105℃杀死组织后，再在80℃下烘至恒重。

(3)记录及计算

编号 称量瓶重 (m1)瓶重 +样品鲜重 (m2)瓶重 +样品干重 (m3)

样品鲜重mf=m2－m1

样品干重md=m3－m1

表2 叶片含水量百分比Table 2 Percentage of leaf water contents

1.4.3 游离脯氨酸 (Pro)含量测定

采用酸性茚三酮法测定游离脯氨酸 (Pro)含量［9］。(1)脯氨酸提取 取不同处理的剪碎混匀叶片0.5g，分别置于大试管中，加入5ml 3%磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球塞，于沸水浴中浸提10min。

(2)取出试管，待冷却至室温后，吸取上清液2ml，加2ml冰乙酸和2ml酸性茚三酮液，于沸水浴中加热30min。

(3)取出冷却后向各管加入4ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层，以甲苯液为对照，在波长520nm下比色测定。

(4)结果计算:从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度，按下式计算样品中脯氨酸含量:

式中 C——提取液中脯氨酸含量 (μg)，由标准曲线求得;

V——提取液总体积 (ml);

a——测定时所吸取提取液的体积 (ml);

W——样品重 (g)。

由公式计算结果单位为:ug/g

表3 脯氨酸含量Table 3 contents of proline

1.4.4 叶绿素 (Chl)含量的测定［9］

(1)色素的提取 取新鲜叶片，剪去粗大的叶脉并剪成碎块，称其0.5g放入研钵中加纯丙酮5ml，研磨成匀浆，再加80%丙酮5ml，将匀浆转入离心管，离心后弃沉淀，上清液用80%丙酮定容至20ml。

(2)测定光密度 取上述色素提取液1ml，加80%丙酮4ml稀释后转入比色杯中，以80%丙酮为对照，分别测定663nm、645nm处的光密度值。

(3)结果计算 由公式Ca+b(mg/l)=8.02OD663+20.21OD645计算出浓度，再计算出鲜叶片含量 (mg/g)。

表4 叶绿素含量的变化Table 4 changes of chlorophyll contents

1.4.5 过氧化氢酶 (CA T)活性测定

过氧化氢酶 (CA T)活性采用高锰酸钾滴定法测定［9］。(1)酶液提取取材料叶片1g，加入PH 7.8的磷酸缓冲液少许，研磨成匀浆，转入容量瓶中定容为25ml，将其4000r/min离心15分钟，上清液即为过氧化氢酶粗提液。

(2)取50ml三角瓶4个 (两个测定，两个对照)，测定瓶各加入酶液2.5ml，对照瓶各加入煮沸后变性酶液2.5ml，再加入2.5ml0.1mol/l的过氧化氢，同时记时，于30度恒温水浴中保温10 min，立即加入10%硫酸2.5ml。

(3)用0.1mol/l高忙酸钾液滴定，至出现粉红色30min内不消失为终点。

表5 过氧化氢酶活性的变化Table 5 Changes of catalase activity

2.结果与分析

2.1 叶片含水量 (RWC)

从总体上看，随着时间的增加自然干旱胁迫加重，两种蕨叶片的含水量均有所下降，但银脉凤尾蕨降低幅度较小，具体变化情况如图2。

图2 叶片含水量百分比Fit 2 Percentage of leaf water content

2.2 叶绿素含量 (CHL)

银脉凤尾蕨和阔叶鳞盖蕨叶片中叶绿素含量随干旱胁迫程度的增加均呈降低的趋势，但是银脉凤尾蕨较阔叶鳞盖蕨含量降低得更慢，体变化情况如图3。

图3 叶绿素含量的变化 (单位:毫克每毫升)Fig 3 changes of chlorophyll contents(unit:mg/g)

2.3 过氧化氢酶活性 (CAT)

从图4可以看出:两种蕨随着干旱胁迫的加重过氧化氢酶活性都先上升在降低，但是银脉凤尾蕨过氧化氢酶活性较阔叶鳞盖蕨变化得更缓慢。

图4 过氧化氢酶活性的变化单位:mg/(g.min)Fit4 Changes of catalase activity(unit:mg/g.min)

2.4 脯氨酸含量 (pro)

从图5可以看出:两种蕨随着干旱胁迫的加重脯氨酸含量都在升高，但银脉凤尾蕨较阔叶鳞盖蕨含量更高。采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减小了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态 (干或鲜样)限制。在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nm处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其光密度成正比。

图5 脯氨酸含量 (单位:ug/g)Fig 5 Contents of proline(单unit:ug/g)

3 结论与讨论

由于叶片相对含水量能反映细胞的水分生理状态，缺水条件下细胞内水分减少，相对含水量下降［10—11］，并且总体变化趋势银脉凤尾蕨较阔叶鳞盖蕨小，稳定性较好，受水分影响较小，所以银脉凤尾蕨较阔叶鳞盖蕨更耐旱。

对叶绿素研究发现，银脉凤尾蕨和阔叶鳞盖蕨叶片中叶绿素含量随干旱胁迫程度的增加均呈降低的趋势，但是各品种的下降幅度不一样，银脉凤尾蕨下降趋势缓慢，最小值较阔叶鳞盖蕨小，再根据叶片叶绿素含量的高低，可直接反应植物对干旱胁迫的抵抗能力，通过测定叶绿素含量的变化可以确定植物抗旱性的强弱［12］，便可得知银脉凤尾蕨抗旱性强于阔叶鳞盖蕨。

过氧化氢酶活性变化银脉凤尾蕨和阔叶鳞盖蕨二者都是先升后隆的变化趋势，但阔叶鳞盖蕨过氧化氢酶活性上升得较快且峰值较大，下降时速度较快峰值较小，受干旱影响变化较大，表现出不稳定状况，并且其在植物体内的作用是过氧化氢酶与超氧化物岐化酶、过氧化物酶协同作用防御活性氧或其它过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害，从而提高植物抗性［13］。所以也不难得出阔叶鳞盖蕨抗旱性较弱这一结论。

脯氨酸作为渗透调节物质之一，能够与细胞内的一些化合物形成类似亲水胶体的聚合物，具有一定的保水作用，在逆境下植物体内脯氨酸的含量显著增加，植物体内脯氨酸的含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗逆性强的品种常常积累较多的脯氨酸。受干旱条件的刺激，细胞内主动积累脯氨酸等渗透调节物质，促使植物加强水分吸收，维持细胞一定的膨压，从而保持细胞生长、气孔开放以及光合作用等生理活动的正常进行［13］。因此，从实验不难看出，银脉凤尾蕨抗旱性较阔叶鳞盖蕨强。

另外，本次实验仅研究了银脉凤尾蕨和阔叶鳞盖蕨干旱胁迫下的生理反应，对其形态特征、解剖结构等方面未作深入研究，有待进一步进行更深入的研究。

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