二型鳞毛蕨多糖提取及含量测定*

罗 琴 林宜昆 王志红 谢启明

(1.楚雄师范学院化学与生命科学系，云南 楚雄 675000;2.德宏师范高等专科学校理工系，云南 德宏 678400)

多糖类化合物是一种免疫调节剂，参与细胞生命现象的调节。已发现100多种中药中的多糖类化合物具有免疫促进作用，这类多糖没有细胞毒性，而药物质量通过化学手段容易控制，已经成为新药的发展方向之一［1］。

近年来对蕨类植物进行分析研究，发现其具有抗微生物和抗肿瘤活性等，但有效成分的分离提取工艺尚需完善。而药用蕨类植物多糖复合物具有多种生理和药理活性，如抗肿瘤、免疫促进、抗凝血、抗补体、抗溃疡、抗病毒和降血糖等，其功能作用限于细胞表面，具有高效低毒的特性［2、3］。

二型鳞毛蕨 (Dryopteris cochleata(Buch.－Ham.ex D.Don)C.Chr.)国内主要分布于四川、贵州、云南等地，属鳞毛蕨属鳞毛蕨科［4］。目前，对二型鳞毛蕨化学成分的研究报到较少，二型鳞毛蕨多糖提取及测定未见报道，本论文通过二型鳞毛蕨多糖提取、工艺优化及二型鳞毛蕨多糖含量测定进行研究，为二型鳞毛蕨的开发利用提供参考。

1.材料与仪器

1.1 材料

二型鳞毛蕨全株，采自云南楚雄市紫溪山，经楚雄师范学院徐成东教授鉴定。采集后迅速干燥后粉碎成干粉，冷冻保存备用。

1.2 试剂

丙酮，甲醇，无水乙醇，苯酚，乙醚，浓硫酸，95%乙醇，葡萄糖标准品 (中国药品生物制品检定所)，以上试剂均为分析纯，实验用水为蒸馏水。

葡萄糖贮备液配制:准确称取经60℃干燥至恒重葡萄糖0.1002g，定容至100ml，得浓度1.002mg/ml贮备液。用时稀释成葡萄糖标准液。

苯酚溶液的配制:取苯酚100g，加入0.1g铝片及0.05g碳酸钠，加热蒸馏，收集182℃馏分6.0g，加蒸馏水100ml溶解，即得6%苯酚溶液，置棕色瓶备用。

1.3 仪器

722型光栅分光光度计 (山东高密彩虹分析仪器公司);索氏提取器;HH－S2S恒温水浴锅 (金坛市大地自动化仪器厂);EX124电子天平 (奥豪斯仪器上海有限公司);9FZ－15型机械粉碎机。

2.实验部分

2.1 多糖的提取工艺及定性鉴定［4—6］

2.1.1 多糖提取工艺

二型鳞毛蕨→洗净→干燥→粉碎→热水浸提→浓缩→浓缩液→醇析→过滤→洗涤→干燥→二型鳞毛蕨多糖。

2.1.2 多糖定性鉴定

(1)苯酚－硫酸法:取少量提取的多糖，滴加加体积比为1∶5的苯酚－硫酸溶液，观察颜色。(2)蒽酮－硫酸法:取少量提取的多糖，滴加加体积比为1∶5的蒽酮－硫酸溶液，观察颜色。

2.2 粗多糖提取工艺优化［7］

2.2.1 提取温度的选择

分别称取10g二型鳞毛蕨样品5份，置于锥形瓶中，按料液比1∶20(g∶ml)加入蒸馏水，分别在不同温度 (50℃、60℃、70℃、80℃、90℃)的水浴锅中加热提取2h，提取2次合并提取液，提取浓缩至40ml，加60.0ml无水乙醇，静置24h，过滤，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，挥发溶剂至干得粗多糖，干燥恒重后称量粗多糖质量，平行测定3次取平均值。

2.2.2 料液比的选择

分别称取10g二型鳞毛蕨样品5份，置于锥形瓶中，分别按料液比 (g∶ml)1∶10、1∶20、1∶25、1∶30、1∶40加入蒸馏水，在80℃水浴中提取2h，提取2次合并提取液，提取液浓缩至40ml，加60.0ml无水乙醇，静置24h，过滤，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，挥发溶剂至干得粗多糖，干燥恒重后称量粗多糖质量，平行测定3次取平均值。

2.2.3 提取时间的选择

分别称取10g二型鳞毛蕨样品5份，置于锥形瓶中，按料液比1∶30(g∶ml)加入蒸馏水，在80℃水浴中分别提取0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h，提取2次合并提取液，提取液浓缩至40ml，加80.0ml无水乙醇，静置24h，过滤，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，挥发溶剂至干得粗多糖，干燥恒重后称量粗多糖质量，平行测定3次取平均值。

2.2.4 醇沉浓度的选择

分别称取10g二型鳞毛蕨样品5份，置于锥形瓶中，按料液比1∶30加入蒸馏水，在80℃水浴中提取2h，提取2次合并提取液，提取液浓缩至40ml，分别加60%、70%、80%、90%乙醇、无水乙醇，静置24h，过滤，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，挥发溶剂至干得粗多糖，干燥恒重后称量粗多糖质量，平行测定3次取平均值。

2.2.5 醇沉时间的选择

分别称取10g二型鳞毛蕨样品5份，置于锥形瓶中，按料液比1∶30加入蒸馏水，在80℃水浴中提取2h，提取2次合并提取液，提取液浓缩至40ml，用80.0ml无水乙醇分别沉淀6h、12h、18h、24h、30h、，过滤，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，挥发溶剂至干得粗多糖，干燥恒重后称量粗多糖质量，平行测定3次取平均值。

2.3 多糖含量测定［8］

2.3.1 绘制标准曲线

分别吸取不同浓度的标准葡萄糖溶液2.00ml置比色管中，加6%苯酚溶液1.00ml，摇匀，迅速加入浓硫酸5.00ml，摇匀，置于冷水中放置15min，以试剂空白溶液为参比液，于490nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线。

2.3.2 换算因子测定

准确称取干燥至恒重的二型鳞毛蕨多糖三份，置于100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，再分别吸取1.00ml于50ml容量瓶中进行稀释，然后吸取2.00ml稀释溶液于比色管中，再分别加入6%苯酚溶液1.00ml，摇匀，迅速加入浓硫酸5.00ml，摇匀，置于冷水浴中放置15min。以试剂空白为参比，于490nm波长处测定吸光度，求换算因子f。

2.3.3 多糖测定

准确称取一定量二型鳞毛蕨，置于索式提取器中，加入80.0ml氯仿和20.0ml甲醇，回流虹吸4次。脱去植物脂质后，加入300.0ml蒸馏水，于80℃水浴中提取2h，提取2次后合并提取液，浓缩至60ml。离心后取清液加入8.0ml氯仿和2.0ml正丁醇，萃取除去蛋白质和顽固脂质 (3次)后转入100ml容量瓶中，用蒸馏水定容。吸取1.00ml于50ml容量瓶中进行稀释，然后吸取2.00ml稀释溶液于比色管中，再分别加入6%苯酚溶液1.00ml，摇匀，迅速加入浓硫酸5.00ml，摇匀，置于冷水浴中放置15min。以试剂空白为参比，于490nm波长处测定吸光度，对照标准曲线，计算二型鳞毛蕨中多糖的含量。

3.结果与分析

3.1 定性检测结果

表1 多糖定性试验结果

定性鉴定结果表明，提取物为多糖化合物。

3.2 提取温度确定

根据2.2.2的方法，结果如图3—1所示。

温度控制在80℃时，多糖产率最高。在50～80℃之间，多糖产率随着温度的升高而增加，而在80～90℃之间，多糖产率逐渐平稳，因此温度宜控制在80℃。

图3 —1 多糖提取温度选择

图3 —2 多糖提取料液比选择

3.3 料液比的确定

根据2.2.2的方法，结果如图3—2所示。料液比在1∶10—1∶30之间时，随着溶剂的增加多糖溶解量增大，但当溶剂量增加到1∶30时多糖已经基本溶出完全，所以再加大溶剂的量多糖的产率增加不明显.所以本试验料液比选择为1∶30。

3.4 提取时间的确定

根据2.2.3的方法，结果如图3—3所示。

图3 —3 多糖提取时间确定

图3 —4 醇沉浓度的确定

在0.5h—2h时随着时间的增加，多糖的产率增加较大，时间超过2h后，多糖在溶剂中已经溶解完全，多糖的产率随时间增大不再改变，因此提取时间以2h为佳。

3.5 醇沉浓度的确定

根据2.2.4的方法，结果如图3—4所示。随着乙醇浓度的增大，多糖产率在增加，且考虑到乙醇较易回收，所以本试验选择无水乙醇来沉淀多糖进行实验。

3.6 醇沉时间的确定

根据2.2.4的方法，结果如图3—5所示。

图3 —5 醇沉时间的确定

图3 —6多糖测定标准曲线

由图3—5可知:随着醇沉时间增大，多糖产率增加，随着醇沉时间增大，二型鳞毛蕨粗多糖产率增加，多糖产率几乎稳定不变，为此本实验较佳醇沉时间为24h。

3.7 绘制标准曲线

根据2.3.1的方法，结果如3—6图所示。根据标准曲线建立回归方程为:

表明在20～10 ug/ml范围内，吸光度与多糖浓度呈良好的线性关系。

3.8 多糖含量测定

3.8.1 换算因子确定

根据2.3.2方法及公式:f=W×106/(C×D)。式中W为二型鳞毛蕨多糖质量 (g)，C为多糖的浓度，D为多糖的稀释倍数，算出多糖的换算因子如下表2所示。

表2 二型鳞毛蕨多糖的换算因子

3.8.2 多糖含量测定

根据2.2.6方法及公式:多糖含量=(C×D×f)/(W×106)，式中W为二型鳞毛蕨的质量 (g)，C为多糖溶液中葡萄糖的浓度 (ug/ml)，D为多糖的稀释倍数，f为换算因子。算出多糖提取率如下表3所示。

表3 二型鳞毛蕨多糖含量测定

4.结论

1.多糖提取工艺中，物料比、提取时间、提取温度、沉淀剂乙醇浓度、沉淀时间对实验结果均有一定影响。实验表明，二型鳞毛蕨多糖提取较佳工艺是:经过干燥 (60℃)粉碎的二型鳞毛蕨样品按料液比为1∶30加入蒸馏水，在80℃水浴中浸提2h，水提液浓缩至20ml，加入无水乙醇沉淀24h，过滤，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤、干燥得到浅黄色二型鳞毛蕨多糖，多糖提取率为二型鳞毛蕨全株干重的2.51%。

2.用苯酚－硫酸比色法对二型鳞毛蕨中多糖含量测定，测得二型鳞毛蕨中多糖含量为2.64%。多糖提取率比测定多糖含量低的原因是，多糖在提取过程中因溶解、洗涤等因素而损失。二型鳞毛蕨多糖的结构及活性有待进一步研究。

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［3］赵莉，杨文钰.蕨类植物的活性成分研究进展 ［J］.中药材，2004，27(6):452—456.

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