逆转录病毒介导系统感染原代培养人皮肤成纤维细胞

张清华 艾 民 蒋知新 沙 杭 高 毅 卢 海

(中国人民解放军三零五医院，北京 100017)

胚胎干细胞(ESCs)是具有无限增殖，自我更新和多向分化潜能的一种未分化细胞，在体外可被诱导分化为神经细胞〔1〕、平滑肌细胞、心肌细胞〔2〕、造血细胞〔3〕而用于多种疾病的治疗，具有广阔的研究和临床应用前景。目前，ESCs研究也存在着一些问题，如免疫排斥反应和伦理学问题的争论。诱导多潜能干细胞技术是将多能性基因转染到已分化的体细胞，将其重编程为类似于ESCs的多潜能干细胞，并被命名为“诱导多潜能干细胞”(iPSCs)，简称“iPS细胞”〔4〕。iPS细胞回避了 ESCs免疫排斥反应和伦理学的争论问题，近年来成为干细胞领域的研究热点。本实验拟采用包装生产携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的逆转录病毒感染原代培养人皮肤成纤维细胞(HSF)，判断逆转录病毒对HSF细胞的感染情况，为下一步HSF细胞重编程实验提供技术保证。

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂 皮肤标本来源于南方医科大学第二临床学院，经患者及其家属同意签字后方可取标本。高糖型DMEM、10%FBS、PBS、明胶、pMX-GFP、pCL 包装质粒、polybrene、磷酸钙转染用试剂盒。

1.2 原代培养HSF细胞〔5〕手术取患者上臂内侧至真皮层2 cm×2 cm皮肤组织标本，用PBS将组织标本清洗3遍后剪碎至1 mm×2 mm左右，将其平铺到包被明胶的培养皿中，添加HSF细胞培养基(高糖型DMEM+10%FBS)，置于37℃ 5%CO2培养箱培养，每天更换HSF细胞培养基。

1.3 包装生产逆转录病毒 采用磷酸钙转染法将GFP基因转染到293T细胞内，具体步骤如下:先加水，再加pMX-GFP和pCL包装质粒混匀。向混合液中加入2 mol/L CaCl2颠倒混匀。再向混合液中加入2×HBS反复吸吹混匀。在室温下静置2 min，加入等体积的293T细胞培养基(高糖型DMEM+10%FBS)，将钙转液逐滴均匀滴加到293T细胞中，置于37℃，5%CO2培养箱培养，12～16 h后更换培养液，36～48 h收集病毒上清液。

1.4 收集病毒感染HSF细胞 应用巴氏吸管收集病毒上清液，经0.45μm滤过膜过滤到15 ml离心试管中，加入终浓度为8 ng/ml polybrene混匀，感染前更换新的HSF细胞培养基，将收集过滤的病毒上清液感染HSF细胞。

1.5 HSF细胞观察 显微镜下观察原代培养HSF细胞的生长过程和包装生产逆转录病毒感染HSF细胞情况，并拍照。

2 结果

2.1 原代培养HSF细胞 人皮肤组织块接种1 w左右，可见少量的HSF细胞从组织块周围爬出，呈长梭形、不规则形。2 w左右组织块周围HSF细胞数量逐渐增多，部分细胞生长密度超过90%，呈放射状、栅栏状或漩涡状排列。见图1。

2.2 包装生产逆转录病毒 利用磷酸钙法将pMX-GFP和pCL包装质粒转染到293T细胞，48 h后荧光显微镜下观察，293T细胞正在包装生产携带GFP基因的逆转录病毒。见图2。

2.3 病毒感染HSF细胞 收集病毒上清液感染HSF细胞，48 h后倒置荧光显微镜下观察，包装生产的逆转录病毒感染绝大多数HSF细胞，被病毒感染的HSF细胞能够稳定表达外源性GFP基因。见图3。

图1 原代培养HSF细胞(×100)

图2 293T细胞(×100)

图3 病毒感染HSF细胞(×100)

3 讨论

HSF细胞位于人皮肤真皮层中，细胞来源广泛充足，取材容易方便，而HSF细胞来源的iPS细胞在干细胞领域具有广阔的研究空间和应用前景，故本实验选择HSF细胞作为逆转录病毒感染的候选细胞。采用组织块贴壁法在体外分离培养出HSF细胞，镜下观察HSF细胞培养过程。一些组织块周围首先出现角质细胞，呈薄膜状，而另一些组织块周围有少量脂肪细胞出现，可能切除皮肤组织标本过厚(至脂肪层)引起。1 w左右部分组织块周围爬出少量HSF细胞，随着细胞培养时间延长HSF细胞数量逐渐增多，形态呈长梭形、不规则形。2 w左右HSF细胞生长密度超过90%，排列呈放射状、栅栏状或漩涡状，此时可进行HSF细胞传代培养和冻存。组织块贴壁法分离培养HSF细胞时间周期相对较长，因此在培养的过程中要注意防止细胞污染。HSF细胞对数生长期为3～6 d，此时HSF细胞生长未受抑制、活力最佳，为逆转录病毒感染HSF细胞最佳研究阶段。

目前，可利用逆转录病毒〔4〕、慢病毒〔6〕、腺病毒〔7〕或转座子〔8〕等介导方式，将外源性目的基因导入体细胞内将其重编程为iPS细胞。本实验利用逆转录病毒为载体将GFP基因导入HSF细胞，评价逆转录病毒感染HSF细胞及被导入外源性基因在细胞内的表达情况。逆转录病毒为携带逆转录酶的RNA病毒，可与多种细胞表面蛋白相结合而进入到细胞内，然后以病毒RNA为模板，在逆转录酶的作用下将RNA转录为cDNA，进一步整合到宿主细胞染色体内，随宿主细胞DNA复制、转录、翻译和表达。逆转录病毒作为载体感染体细胞具有感染细胞范围广、病毒滴定度高、携带外源性基因容量大、整合到细胞DNA中能够使外源性基因在细胞内稳定表达等优点。首先，应用磷酸钙法将pMX-GFP和pCL包装质粒转染到293T细胞后，倒置荧光显微镜对比明、暗视野下不带绿色荧光和带绿色荧光293T细胞。结果显示，逆转录病毒成功的感染293T细胞，表明携带GFP基因已转染到293T细胞内，293T细胞成功包装生产携带GFP基因的逆转录病毒。在pMX-GFP和pCL包装质粒转染293T细胞48 h后，收集病毒上清液感染原代培养HSF细胞，48 h后在倒置荧光显微镜下对比带绿色荧光(暗视野)和不带绿色荧光(明视野)HSF细胞。结果显示大多数HSF细胞被包装生产后的逆转录病毒感染，逆转录病毒将外源性GFP基因成功的转染到HSF细胞内，细胞能够稳定的表达外源性GFP基因。上述实验表明逆转录病毒可作为有效的基因转移载体，将外源性基因转移到HSF细胞内，为下一步将其重编程为iPS细胞提供技术保障。

1 Carpenter MK，Inokuma MS，Denham J，et al.Enrichment of neurons and neural precursors from human embryonic stem cells〔J〕.Exp Neurol，2001;172(2):383-97.

2 Mummery C，Ward D，van den Brink CE，et al.Cardiomyocyte differentiation of mouse and human embryonic stem cells〔J〕.JAnat，2002;200(Pt 3):233-42.

3 Kaufman DS，Hanson ET，Lewis RL，et al.Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2001;98(19):10716-21.

4 Takahashi K，Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors〔J〕.Cell，2006;26(4):663-76.

5 Park IH，Lerou PH，Zhao R，et al.Generation of human-induced pluripotent stem cells〔J〕.Nat Protoc，2008;3(7):1180-6.

6 Yu J，Vodyanik MA，Smuga-Otto K，et al.Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells〔J〕.Science，2007;318(5858):1917-20.

7 Stadtfeld M，Nagaya M，Utikal J，et al.Induced pluripotent stem cells generated without viral integration〔J〕.Science，2008;322(5903):945-9.

8 Kaji K，Norrby K，Paca A，et al.Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors〔J〕.Nature，2009;458(7239):771-5.