胃蛋白酶前处理对大豆蛋白酶解特性的影响*

赵谋明 张远红 崔春 源博恩

(华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640)

大豆蛋白是一种营养丰富的优质植物蛋白，是食品工业中重要的蛋白质资源.大豆蛋白食品消费量逐年增长，提高其营养价值的有效利用和加工性能一直是大豆蛋白深加工领域发展的主题.研究表明，大豆蛋白酶解可产生一系列具有生理活性的多肽，从而达到提高大豆蛋白营养价值的效果［1］.

大豆蛋白主要由 β-伴球蛋白(7S)和球蛋白(11S)组成.7S是由非共价键稳定的三聚体糖蛋白，研究表明，7S热不稳定且易被酶水解［2］.11S是由二硫键连接酸性亚基和碱性亚基而成的六聚体，分子高度压缩、结构紧密，对蛋白酶的酶解作用具有较强的抵抗力［3-4］，是限制大豆蛋白酶解效率的关键因素.因此，必须考虑对大豆蛋白的11S组分进行前处理，使其致密的结构变得松散，以利于高效酶解［5］.前处理手段一般包括物理手段、化学手段和酶法手段.有研究发现，11S组分在酸性条件下会发生亚基解离［6］，紧密结构展开，从而有利于酶解的进行［7］.基于胃蛋白酶作用最适 pH 值为 1.5 ～2.2，对11S具有选择性优先水解的独特效果［7-8］，文中结合化学法和酶法对大豆蛋白进行前处理，先采用胃蛋白酶处理大豆蛋白，然后用碱性蛋白酶和复合蛋白酶进行酶解，针对酶解产物的十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白回收率、水解度、抗氧化性以及分子质量分布进行了一系列的分析，以期为功能性大豆肽的生产提供理论和方法上的指导.

1 材料与方法

1.1 主要原料

主要原料如下:低温脱脂豆粕，山东禹王实业有限公司产品;胃蛋白酶(酶活600～1000 U/mg)，北京鼎国生物技术有限公司产品;碱性蛋白酶，奥博星生物技术有限公司提供(测定酶活33.6万U/g);复合蛋白酶，诺维信公司提供(测定酶活17.3万U/g);荧光物质Sodium Fluorescein、自由基产生剂AAPH，美国Sigma公司产品.电泳试剂为电泳级，其他试剂均为分析纯.

1.2 仪器与设备

主要仪器与设备如下:320-S数显pH计，瑞士梅特勒－托利多公司生产;DYY-Ⅲ28A电泳槽，北京六一仪器厂生产;紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司生产;KDN-40消化炉，上海新嘉电子有限公司生产;KDN-2C型蛋白质测定仪，上海纤检仪器有限公司生产;Amersham蛋白质分析纯化系统，Amersham中国有限公司生产;Varioskan Flash多功能酶标仪，芬兰Thermo Scientific公司生产.

1.3 实验方法

1.3.1 大豆蛋白溶液的制备

采用碱溶酸沉法［9］提取大豆蛋白.称取一定量的低温脱脂豆粕与去离子水按1∶15(体积比)的比例混合，用2mol/L NaOH调节pH值至7.5，浸提1h后在6000r/min下离心10min去除残渣，以2mol/L的HCl溶液调节pH值至4.5，酸沉后6000r/min下离心10min，所得沉淀加5倍体积的去离子水复溶，配成大豆蛋白溶液，备用.

1.3.2 酶解方法

将上述配好的大豆蛋白溶液平均分成两份.一份先用胃蛋白酶在pH=2.0、37℃、加酶量3‰(酶/底物)条件下酶解到最适时间后立即调节pH值至8.5，稳定30 min后，加1%的碱性蛋白酶在50℃下酶解;另一份则不经过胃蛋白酶前处理，直接调节pH值至8.5，加1%的碱性蛋白酶在50℃下酶解，酶解过程中用2 mol/L NaOH维持pH值恒定.取样时间为 0、1、2、4、8、12、22、24 h，酶解至终点时将酶解液置于100℃水浴中加热10 min灭酶，冷却至室温后于10000r/min下离心20min，将所得上清液称重后冷冻以备检测.按照相同步骤，用复合蛋白酶代替碱性蛋白酶，酶解温度为50℃，pH值为8.0，测定复合蛋白酶的酶解效果.

1.3.3 SDS-PAGE 分析

SDS-PAGE 参照 Laemmli［10］的方法.分离胶质量分数为12%，浓缩胶质量分数为5%.电泳前将已和样品缓冲液混合的样品煮沸5min，并在10000r/min下离心5min，取15μL上清液进样.凝胶电泳于恒流下进行，浓缩胶中电流为40 mA，进入分离胶后增至80mA，凝胶染色及脱色后，于凝胶成像系统进行成像处理.

1.3.4 蛋白质回收率的测定

用凯氏定氮法测定大豆蛋白酶解上清液中蛋白氮含量［11］，按下式计算蛋白回收率:

式中:X1为大豆蛋白酶解上清液蛋白含量，%;X2为大豆蛋白溶液蛋白含量，%;m为大豆蛋白酶解上清液质量，g;M为大豆蛋白酶解液质量，g.

1.3.5 水解度的测定

水解度(DH)的测定采用OPA法［12］:

其中，h为断裂肽键数，总肽键数htot(大豆蛋白)=7.8.

1.3.6 酶解液抗氧化活性评价

酶解液抗氧化活性评价采用ORAC值法.ORAC 值的测定参照 Hernández等［13］的方法.将待测样品溶于75mmol/L磷酸盐缓冲液中配成质量浓度为0.1 g/L的溶液，取20 μL加入96孔荧光板微孔中，再添加20μL磷酸盐缓冲溶液(75 mmol/L)及20μL荧光溶液(70 nmol/L)，在37℃下预置15 min后，加入12mmol/L AAPH 140μL启动反应，以激发波长485nm、发射波长538nm进行测定，每2min测定一次荧光强度，测定时间设定在荧光衰减呈基线后为止，即设为2 h.ORAC值是将荧光衰退曲线的保护面积与标准抗氧化物质(Trolox)的保护面积相比得出，以每克肽中的Trolox当量(μmol)表示.

1.3.7 酶解液的分子质量分布测定

采用Amersham蛋白质分析纯化系统测定大豆蛋白酶解液分子质量分布.凝胶渗透色谱(GPC)条件如下:Superdex-peptide，10/300-GL玻璃柱，洗脱液为0.25mmol/L NaCl，pH=7.2 的磷酸盐缓冲液，流速为0.5mL/min，检测波长为214nm.标准肽样品与洗脱液体积拟合方程为lgG=－0.0578V+4.6289(r2=0.99)，式中lgG为标准肽相对分子质量的常用对数，V为洗脱液体积.

1.4 数据统计与分析

数据均为3次测定的平均值，并使用Origin Pro 8.0 作图.

2 结果与分析

2.1 SDS-PAGE 图谱分析

图1所示为不同酶解时间下的SDS-PAGE图谱.从图1中可以看出:随着酶解的进行，大豆蛋白11S组分的亚基条带逐渐消失，到2 h时完全消失，表明此时11S组分全部被胃蛋白酶酶解;而随着酶解时间的延长，7S亚基条带变化不明显，说明胃蛋白酶对7S敏感性较低.因此，实验中选用胃蛋白酶酶解2h作为前处理条件.

图1 胃蛋白酶酶解大豆蛋白不同时间下的SDS-PAGE图谱Fig.1 SDS-PAGE patterns of soy protein hydrolysates hydrolyzed by pepsin with different time

图2所示为大豆蛋白酶解产物的SDS-PAGE图谱.从图2中可以看出，胃蛋白酶酶解2 h后，11S亚基条带亮度显著减弱，而7S亚基条带变化不明显.这与图1的结果相符.从条带7－10和16－19可以看出，单独使用碱性蛋白酶酶解时，酶解主要作用在7S和11S的酸性亚基上，酶解速度很快，酶解1h已经降解几乎全部的目标亚基，但对碱性亚基作用较弱，酶解24h后依然有碱性亚基存在，酶解产物分子质量最大在20ku左右;而单独使用复合蛋白酶酶解时，酶解速度较慢，酶解主要作用于7S，对11S的酸性亚基有较弱作用.使用胃蛋白酶酶解2h作为前处理，在很大程度上提高了这两种蛋白酶的酶解效率.从条带3－6和12－15可以看出，碱性蛋白酶酶解产物分子质量最大在14ku左右，酶解24h后几乎所有的亚基被酶解;而复合蛋白酶酶解时，不仅7S被酶解，11S也被酶解完全，酶解8h后，几乎所有的大豆蛋白亚基被分解.因此，胃蛋白酶前处理可以提高大豆蛋白的酶解效果，特别是对碱性蛋白酶的协同作用较强.

图2 大豆蛋白酶解产物的SDS-PAGE图谱Fig.2 SDS-PAGE patterns of soy protein hydrolysates

2.2 胃蛋白酶前处理对大豆蛋白回收率的影响

图3给出了不同酶解处理对大豆蛋白回收率的影响.由图3(a)可知，胃蛋白酶酶解2h的样品蛋白回收率达到了56.8%，这是因为在酸性条件下，大豆蛋白发生亚基解离，蛋白紧密结构展开，在胃蛋白酶的作用下11S被迅速分解.继续用碱性蛋白酶水解，随着酶解时间的延长，蛋白回收率不断提高，24h时达到95.4%，与单酶酶解相比，蛋白回收率提高了39.9%.图3(b)中复合蛋白酶单独酶解1h的样品由于水解程度比较低，在灭酶后离心分离时未能离心出上清液，因而，无法准确测得其蛋白回收率.图3(b)中复合蛋白酶酶解亦有与图3(a)相同的趋势，24h时回收率达到72.2%，蛋白回收率与单酶水解相比提高了19.4%.这表明，胃蛋白酶前处理可显著提高这两种酶的作用效果，特别是对碱性蛋白酶作用效果的增强更为明显.

图3 不同酶解处理对大豆蛋白回收率的影响Fig.3 Effect of different enzymatic treatment on soy protein recovery

2.3 胃蛋白酶前处理对大豆蛋白水解度的影响

图4给出了不同酶解处理对大豆蛋白水解度的影响.从图4可以看出，经过胃蛋白酶处理2 h后大豆蛋白水解度达到2.8%，说明胃蛋白酶酶解过程中大豆蛋白部分肽键断裂，释放出一些肽段或游离氨基酸，这与Kong等［14］的研究结果相似.从图中还可以看出，随着酶解时间的延长，蛋白水解度不断增大.单独使用碱性蛋白酶和复合蛋白酶对大豆蛋白酶解24h后，水解度分别达到17.0%和11.3%.而经过胃蛋白酶处理2 h后再用这两种蛋白酶进行酶解，可提高大豆蛋白水解度，分别达到23.1%和12.2%，与未使用胃蛋白酶前处理相比分别提高了35.9%和8.0%;其中复合蛋白酶酶解水解度提高不显著，这可能与该酶作用的特异性有关.胃蛋白酶前处理后水解度提高的原因是:pH=2.0条件下，大豆蛋白发生亚基解离，在胃蛋白酶作用下，部分肽键断开，分子结构展开，暴露出更多的酶作用位点，从而有利于大豆蛋白的进一步酶解，增强了酶解效率和酶解敏感性.对比图4(a)和4(b)可知，碱性蛋白酶的作用效果明显优于复合蛋白酶.

图4 不同酶解处理对大豆蛋白水解度的影响Fig.4 Effect of different enzymatic treatment on degree of hydrolysis of soy protein

2.4 胃蛋白酶前处理对大豆蛋白抗氧化活性的影响

ORAC值法测定抗氧化活性的作用原理是一种经典的通过抑制氢转移反应过程终止自由基链式反应.ORAC值法具有高度的灵敏性［15-16］，其自由基来源为偶氮类化合物AAPH热分解产生的过氧自由基，这些自由基与生命现象中的自由基具有高度的一致性.文中利用ORAC值法评价酶解产物的抗氧化活性.

图5所示为不同酶解处理对大豆蛋白酶液抗氧化活性的影响.从图5中可以看出，酶解产物的抗氧化能力均随着酶解时间的延长呈现先上升后降低的趋势.这是因为酶解过程中某分子质量段的肽段具有较强的抗氧化能力，酶解前期随着这部分分子质量的肽段不断增多，抗氧化性提高，而酶解后期随着这部分分子质量的肽段逐渐被降解成更低分子质量的肽段或游离氨基酸，抗氧化性下降.这与任娇艳等［17］的研究结果相似.未经酶解处理的大豆蛋白的ORAC值只有165.2，而经过胃蛋白酶处理2 h后的样品，其ORAC值分别提高到431.7和407.4(见图5).这说明胃蛋白酶处理所得产物具有一定的抗氧化活性.使用碱性蛋白酶和复合蛋白酶进行单酶酶解的样品，抗氧化能力最强时都出现在12 h左右，分别达到778.5和715.4.而经过胃蛋白酶前处理后再用这两种蛋白酶进行酶解，产物ORAC值都比未经过前处理的要高，最大值出现在8h处，达到1078.6和794.6，与单酶水解相比分别提高了38.5%和11.1%，这说明胃蛋白酶前处理可以提高大豆蛋白酶解产物的抗氧化性.同时，碱性蛋白酶酶解产物抗氧化性要高于复合蛋白酶的酶解产物，这可能与酶作用的特异性有关.因此，选择碱性蛋白酶进一步酶解对增加大豆蛋白抗氧化性具有较好效果.

图5 不同酶解处理对大豆蛋白酶解液抗氧化活性的影响Fig.5 Effect of different enzymatic treatment on ORAC value of soy protein hydrolysates

2.5 大豆蛋白酶解液的分子质量分布

从表1可以看出，随着水解时间的延长，大分子组分(分子质量大于10ku)逐渐减少，小分子组分(分子质量小于5ku)逐渐增多;且经过胃蛋白酶前处理的样品，其低分子质量肽段的含量明显高于单酶酶解的样品.表1中复合蛋白酶单酶水解1h的产物由于未分离出上清液而未测得其分子质量分布.胃蛋白酶水解2h后分子质量小于5ku的组分含量达到44.1%，这是因为在酸性条件下胃蛋白酶水解了11S，产生了一定量的小分子组分.继续用碱性蛋白酶和复合蛋白酶酶解，大分子组分(分子质量大于10ku)含量不断减少，从29.1%分别下降到5.5%和9.0%，而小分子组分(分子质量小于5ku)逐渐增多，在24h时含量分别达到85.4%和78.6%.这说明，用这两种酶继续酶解可使大豆蛋白进一步降解.同时，与单酶酶解相比，经过胃蛋白酶前处理的产物中分子质量大于10ku的组分明显降低，而分子质量小于5 ku的组分显著增加(在24h时分别增加了7.6%和17.6%).这表明，胃蛋白酶前处理能促进大豆蛋白的进一步酶解.

表1 不同酶解处理产物的分子质量分布Table 1 Molecular weight distribution of hydrolysates by different enzymatic treatment

3 结论

(1)胃蛋白酶前处理可使大豆蛋白回收率和水解度显著增加，提高大豆蛋白对碱性蛋白酶、复合蛋白酶的酶解敏感性，这说明胃蛋白酶与碱性蛋白酶和复合蛋白酶具有协同增效作用，特别是对碱性蛋白酶的提高效果更明显.

(2)胃蛋白酶前处理后的酶解产物ORAC值(即抗氧化值)得到提高，最高可达到1078.6，这说明，胃蛋白酶前处理可提高酶解产物中大豆肽的抗氧化活性.

(3)对酶解产物的SDS-PAGE凝胶电泳分析和分子质量分布分析可知，胃蛋白酶前处理可加快酶解过程，有利于小分子肽的生成.

［1］李荣和.大豆新加工技术原理与应用［M］.北京:科学技术文献出版社，1999:40-57.

［2］Iwabuchi S.Thermal denaturation of β-conglycinin ［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1991，39(1):27-32.

［3］胡爱军，郑捷.大豆蛋白酶解技术比较［J］.精细化工，2005，22(6):461-463.Hu Ai-jun，Zheng Jie.Comparison of enzymatic hydrolysis technologies of soybean protein ［J］.Fine Chemical Engineering，2005，22(6):461-463.

［4］Fisher A V.A review of the technique of estimating the composition of livestock using the velocity of ultrasound［J］.Computers and Electronics in Agriculture，1997，17(10):217-231.

［5］Tang S H，Navam S.Protein extraction from heat-stabilized defatted rice bran.1 physical processing and enzyme treatments［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50(25):7444-7448.

［6］源博恩，赵强忠，赵谋明.酸性条件下高压均质对大豆蛋白结构与功能特性的影响［J］.食品工业科技，2012，33(8):79-82.Yuan Bo-en，Zhao Qiang-zhong，Zhao Mou-ming.Effects of high-pressure homogenization in acid condition on the structure and functional properties of soybean proteins［J］.Science and Technology of Food Industry，2012，33(8):79-82.

［7］Kazunobu T.Improvement of the physicochemical properties of soybean proteins by enzymatic hydrolysis［J］.Food Science and Technology Research，2009，15(4):381-388.

［8］刘晓毅，薛文通，胡小苹，等.酶解法专一性去除大豆7S球蛋白中的 α-亚基［J］.食品科技，2005，8(8):16-18.Liu Xiao-yi，Xue Wen-tong，Hu Xiao-ping，et al.Special removal α-subunit of 7S globulin from soybean by enzymatic hydrolysis［J］.Food Technology，2005，8(8):16-18.

［9］Luo Donghui，Zhao Qiangzhong，Zhao Mouming，et al.Effect of limited proteolysis and high-pressure homogenisation on structural and functional characteristics of glycinin ［J］.Food Chemistry，2010，122(1):25-30.

［10］Laemmli U K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 ［J］.Nature，1970，227(5259):680-685.

［11］赵新淮，冯志彪.蛋白质水解物水解度的测定［J］.食品科学，1994，1(11):65-67.Zhao Xin-huai，Feng Zhi-biao.The measurement of the degree of protein hydrolysates［J］.Food Science，1994，1(11):65-67.

［12］Nielsen P M，Petersen D，Dambmann C.Improved method for determining food protein degree of hydrolysis［J］.Journal of Food Science，2001，66(5):642-646.

［13］Hernández L B，Amigo L，Recio I，et al.ACE-inhibitory and radical-scavenging activity of peptides derived from beta-lactoglobulin f(19-25).Interactions with ascorbic acid［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007，55(9):3392-3397.

［14］Kong Xiangzhen，Zhou Huiming，Qian Haifeng.Enzymatic preparation and functional properties of wheat gluten hydrolysates［J］.Food Chemistry，2007，101(2):615-620.

［15］Prior R L，Wu X L，Schaich K.Standardized methods for the determination of antioxidiant capacity and phenolics in foods and dietary supplements［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53(10):4290-4302.

［16］续洁琨，姚新生，栗原博.抗氧化能力指数(ORAC)测定原理及应用［J］.中国药理学通报，2006，22(8):1015-1021.Xu Jie-kun，Yao Xin-sheng，Li Yuan-bo.Oxygen radical absorbance capacity assay and its application ［J］.Chinese Pharmacological Bulletin，2006，22(8):1015-1021.

［17］任娇艳，郑赛晶，刘百战，等.花生抗氧化肽的制备及其在卷烟滤嘴中的应用［J］.现代食品科技，2011，27(9):1084-1089.Ren Jiao-yan，Zheng Sai-jing，Liu Bai-zhan.Preparation of antioxidant peptides from peanut protein and their application as cigarette tip additives［J］.Modern Food Science and Technology，2011，27(9):1084-1089.