番石榴叶杂源萜类中抗糖尿病活性成分的虚拟筛选*

刘美凤 谷灵灵 蒋利荣 周惠

(1.华南理工大学化学与化工学院，广东广州510640;

2.华南理工大学广东省绿色化学产品技术重点实验室，广东广州510640)

番石榴(Psidium guajava)为桃金娘科番石榴属植物.番石榴叶资源丰富，化学成分多样，不仅有止泻、降血压［1］、保护心脏［2］的作用，还具有明显的降糖作用，且临床疗效显著［3-5］.番石榴叶单方制剂“消渴降糖胶囊”已收载于《卫生部药品标准中药成方制剂》第十五册［6］，用于糖尿病及其并发症的临床防治.但该制剂具体的活性成分和作用机制尚未明确.

蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)、激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、过氧化物酶体增殖物激活受体 α(PPARα)、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶是与治疗糖尿病相关的靶标.PTP1B通过对胰岛素受体激酶(IRK)或IRK活性片段的磷酸化络氨酸残基的去磷酸化对胰岛素信号传导起负向调节作用［7］，从而阻断胰岛素与受体结合过程的信号转导［8］;PPARγ可增强胰岛素与其受体结合的信号传导，提高胰岛素的敏感性，从而有效降低血糖;PPARα是脂肪代谢的关键调控因子，广泛用于肥胖、胰岛素抵抗和2型糖尿病的研究中［9］;α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶是抑制碳水化合物水解的酶，可减缓葡萄糖的吸收，从而降低餐后高血糖.目前常用的降糖药有磺脲类、双胍类、噻唑烷二酮类、葡萄糖苷酶抑制剂、苯甲酸衍生物类.Fu等［10］从番石榴叶中得到了3种新二醛杂源萜类化合物Psidial A、Psidial B、Psidial C，发现虽然其对癌细胞活性不明显，但是在浓度为10μmol/L时，Psidial B、Psidial C对 PTP1B的抑制率分别达到61.7%、38.8%.这两种化合物均含有3，5-二醛基倍半萜结构，从而提示番石榴叶二醛杂源萜类化合物中可能含有降糖活性更强的成分或增效物质.文中采用Accelrys Discovery Studio 2.5中基于CHARMm力场的柔性对接程序CDOCKER［11］，以从番石榴叶和桉叶中分离得到的13个二醛杂源萜［12-14］为配体，PTP1B、PPARγ、PPARα、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶为受体，进行降糖活性成分的虚拟筛选，从分子水平上了解小分子化合物的降糖机理，为番石榴二醛类降糖药的设计和结构修饰提供理论参考，以期为降糖药物的研发提供指导和帮助.

1 实验材料与方法

1.1 小分子配体的准备

图1 番石榴叶和桉叶中分离得到的13种二醛杂源萜类化合物的化学结构Fig.1 Chemical structures of 13 dialdehyde meroterpenoid compounds from Psidium guajava and Eucalyptus globulus leaves

首先在画图软件ChemDraw Ultra 7.0中画出13种二醛杂源萜的结构［10，12-14］(见图 1)，直接拷贝到Discovery Studio(DS)中.由于配体数目较多，还要考虑对映异构体等因素，所以采用DS中的Prepare Ligand处理该体系，通过此操作不仅可以对小分子的构象进行能量优化处理，产生三维结构，加氢，还可以产生异构体.13种二醛杂源萜化合物经过这样的处理后产生了53种用于对接的配体分子.

1.2 蛋白文件的处理

文中所用 PTP1B(2HNP)、PPARγ(3PRG)、PPARα(3FEI)、α-淀粉酶(1PPI)、α-葡萄糖苷酶(2ZEO)的晶体结构均源自布鲁克海文蛋白质数据库，括号中所示均指代码.对上述蛋白的处理如下:使用DS打开下载的晶体三维结构模型，除去水分子;去除蛋白多构象，补充非完整的氨基酸残基，为蛋白添加极性氢;最后给蛋白施加CHARMm力场得到用于对接的蛋白.

1.3 分子对接

对接过程如下:定义蛋白为受体，寻找受体中可能的结合部位，最大的结合位点被用于和配体做对接.当对接完成后，分子对接的结果根据对接能大小进行打分，对接能是小分子和蛋白的结合能，该值越小，证明受体与配体的对接亲和力越大，即预测小分子与受体结合的活性越高;另外通过DS软件分析得到配体与受体的氢键数，洞察那些对配体结合有重要贡献的氨基酸残基.

2 结果与讨论

2.1 配体与受体的对接结果

配体和PTP1B对接完成后，共产生了70个对接位点，详见表1.

表1 配体与PTP1B的对接结果Table 1 Docking results of PTP1B with ligands

Euglobal Iia的亲和活性最强，其分子对接效果见图2(a).由二维平面图可知，配体Euglobal Iia二醛结构中的一个氧原子与受体的Ser216残基之间存在明显的氢键作用，距离为0.23 nm.苯环上的羟基与Lys116存在明显的氢键作用，距离为0.18nm.苯环自身和Arg221形成键，距离为0.54nm.另外，配体Euglobal Iia延伸至受体内部，被氨基酸残基包围，与酶分子形成了较强的疏水作用.

配体与PPARγ分子对接完成后，共产生了70个对接位点，详见表2.

表2 配体与PPARγ的对接结果Table 2 Docking results of PPARγ with ligands

Euglobal Ib的亲和活性最强，其分子对接效果见图2(b).由二维平面图可知，配体Euglobal Ib处于 Leu330、Ile326、Ala292、Ile341、Tyr327 等的包围之中.这可能是因为这些残基与配体的相互作用增强了配体与受体的结合能力，从而使该配体的活性提高.

配体与PPARα对接完成后，共产生了60个对接位点，详见表3.

表3 配体与PPARα的对接结果Table 3 Docking results of PPARα with ligands

Euglobal Ic的亲和活性最强，其分子对接效果见图2(c).由二维平面图可知，配体Euglobal Ic侧链吡喃环上的氧原子与Ala333形成氢键，成键距离为0.23nm.

图2 Euglobal Iia、Euglobal Ib、Euglobal Ic 的分子对接效果图(单位:nm)Fig.2 Molecular docking charts of Euglobal Iia，Euglobal Ib and Euglobal Ic(Unit:nm)

2.2 配体与受体的氢键数

通过DS软件还可观察对接位点数与受体每个氨基酸残基形成的氢键数.配体在和PTP1B对接时，氨基酸残基 Lys116、Lys120、Arg221、Tyr46 具有重要贡献，它们与70个对接位点形成的氢键数较多，分别是20、16、16和8;配体在和 PPARγ对接时有70个位点，氨基酸残基 Glu343、Ser342、Ser289、Cys285与这些对接位点形成的氢键数较多，分别是32、27、19和9;配体在和PPARα对接时有60个位点，氨基酸残基 Ala333、Thr279、Cys276、Tyr334 与这些对接位点形成的氢键数较多，分别是33、20、10和8.

2.3 讨论

通过分子模拟的方法，筛选番石榴叶中能与PTP1B、PPARγ、PPARα、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶对接的二醛杂源萜化合物，结果发现:

(1)杂源萜类化合物与 PTP1B、PPARγ、PPARα有对接位点，而与 α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶均无对接位点.这可能是由于 α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的结合空腔过于狭窄，而DS比较适合球形空腔的分子对接，因此没有找到对接位点.

(2)13个二醛杂源萜类成分与PTP1B、PPARγ、PPARα对接时分别产生了共70、70、60个对接位点，但番石榴叶中的 Diguajadial、Guajadial、Psidial A、Psiguadial A以及EuglobalⅢ、EuglobalⅤ与 PTP1B、PPARγ、PPARα、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶无结合位点.分析其结构发现，苯二醛所连侧链比较复杂，因此无结合位点，这可能与其结构复杂、空间位阻大有关系.

(3)由表1可知，Psidial B、Psidial C和 PTP1B有对接位点，这在一定程度上佐证了 Fu等［10］对Psidial A、Psidial B、Psidial C抑制PTP1B的研究.

(4)来源于桉叶中的Euglobal Ib、Euglobal Ic、Euglobal Iia这3种小分子物质与上述5种受体的结合活性均较高，这与其结构简单、空间位阻小有一定关系，同时也佐证了文献所述的桉叶粗提物对兔具有降血糖的功效［15］.另外，通过分析 Euglobal Ib、Euglobal Ic、Euglobal Iia的结构，可发现这3种小分子物质是同分异构体，只是手性有差别.由二维平面图分析可知，配体中的二醛结构和吡喃环在对接的过程中具有重要作用，与受体活性部位间通过键、疏水作用和氢键作用相互结合，可为开发番石榴二醛类降糖药的结构设计和结构修饰提供参考.

(5)通过第 2.2 节中配体与 PTP1B、PPARγ、PPARα形成的氢键数分析，发现一些氨基酸残基在配体与受体的结合中具有重要贡献，这对新药靶点的发现和药物设计有重大意义.Thomas等［16］的研究也认为，在患者出现糖尿病症状之前，血液中酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸5种氨基酸水平均出现了异常升高的现象.可见，尚需进一步研究与糖尿病密切相关的氨基酸，这对糖尿病的预防和治疗将有一定的帮助.

3 结语

文中采用虚拟筛选的方法研究了13个二醛杂源萜类化合物与糖尿病相关靶标的相互作用，发现Euglobal Iia、Euglobal Ib、Euglobal Ic 具有较强的结合能力，这和它们所含的二醛结构以及吡喃环有关，它们可以和周围的氨基酸残基通过氢键或疏水作用相互结合.因此，在对降糖药物的立体结构改造中可引入二醛结构或吡喃环，提高其与糖尿病靶标对接的亲和性.分子模拟方法针对性强，是一种较好的药物筛选手段，是新药研究和开发的有效途径之一，将会在今后的药物研究中继续发挥其重要作用.

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