肺炎衣原体实时定量PCR 检测方法的建立

李林海，陈丽丹，廖杨，陈建芸，石玉玲

(广州军区广州总医院检验科，广东广州 510010)

肺炎衣原体(chlamydia pneumonia，Cpn)是一种在细胞内寄生的革兰染色呈阴性的微生物，是20世纪80年代发现的呼吸道致病微生物，可引起哮喘、肺炎以及急性支气管炎等疾病［1-3］。Cpn主要通过呼吸道的分泌物进行传播，因此，在人口较为密集的地方很容易出现流行。目前临床上检测肺炎衣原体的方法很多，主要有细胞培养分离法、直接或间接免疫荧光法、酶联免疫吸附法以及多聚酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)法，但是以上方法均存在一定的局限性［4-5］。我院针对Cpn建立了实时定量PCR检测方法，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 对象

研究对象为2010年1月至2011年5月于我院住院治疗的呼吸道感染患者，共200例，其中男124例，女76例，年龄4～67岁，平均34.5岁。所有患者均采集咽拭子样本，其中68例患者采集肺泡冲洗液样本。

1.2 材料、试剂和仪器

呼吸道病原微生物(肺炎支原体、肺炎双球菌、流感病毒、副流感病毒以及腺病毒等)由本院保存。

Cpn PCR根据primer 5.0设计由上海英骏生物公司合成;SYBR Green通用型qPCR Master Mix购自罗氏生物;Real-time PCR扩增仪购自Applied Biosystems;TWAR免疫荧光试剂盒购自美国Sigma公司。

1.3 实验方法

1.3.1 引物设计 根据GenBank已公布的肺炎衣原体基因序列，选取高特异和高保守的16S核糖体蛋白基因设计 PCR引物，引物序列如下:CpnF:5'-TGA AGT CGG AAT TGC TAG TAA TGG-3';CpnR:5'-GTG TGT ACA AGG CCC GGG AAC-3'。扩增基因片段长度为450 bp。

1.3.2 基因组 DNA的提取 将500 μl Cpn、肺炎支原体、肺炎双球菌、流感病毒、副流感病毒以及腺病毒等标准液置于1.5 ml离心管中，再加入等体积的酚 ∶氯仿 ∶异戊醇(25 ∶24 ∶1)，在4 ℃下以12 000 r·min－1离心15 min，吸取上清;并向上清加入等体积预冷的异丙醇和1/10体积3 mmol·L－1醋酸铵溶液，轻轻混匀后，置于冰上30 min;待有絮状物形成后4℃下12 000 r·min－1离心15 min，弃上清;用70%冰乙醇洗涤沉淀2次，4 ℃下12 000 r·min－1离心 15 min，弃上清;最后溶解于50 μl TE缓冲液中，－20℃保存作为引物特异性分析的模板。

1.3.3 RT-PCR反应 反应体系:2×SYBR Green mix 12.5 μl，CpnF/CpnR 引物(10 μmmol·L－1)各 1 μl，模板1 μl，补双蒸水至终体积为25 μl。将上述的反应液加入 real time PCR 管中，以1 000 r·min－1离心 1 min，使反应液全部甩到管底。然后将PCR管放入PCR仪中进行反应，反应采用两步法进行。预变性:95℃，30 s;变性:95℃，3 s;退火延伸:60℃，30 s;构建溶解曲线。反应结束后对结果进行分析。

1.3.4 引物特异性分析 将Cpn、肺炎支原体、肺炎双球菌、流感病毒、副流感病毒以及腺病毒的基因组DNA稀释到50 ng·μl－1，按上述PCR反应体系以及条件进行反应，分析引物的特异性;将 Cpn的基因组DNA 倍比稀释为 6 个不同的浓度(200.0、40.0、8.0、1.6 ng·μl－1，320.0、64.0 pg·μl－1)，模板 1 μl，按照上述反应体系和条件分析PCR的最低DNA检出浓度。

1.3.5 RT-PCR检测临床样本 直接以咽拭子样本和肺泡冲洗液样本作为模板，模板5 μl，按上述反应体系和条件进行PCR，分析样本的阳性率。

1.3.6 免疫荧光检测临床样本 采用免疫荧光呼吸道6种病原体IgM+IgG联合检测试剂盒，对咽拭子样本和肺泡冲洗液样本进行分析。6种呼吸道病原菌分别为Cpn、肺炎支原体、肺炎双球菌、流感病毒、副流感病毒以及腺病毒。

2 结 果

2.1 引物特异性以及溶解曲线分析

本实验以肺炎支原体、肺炎双球菌、流感病毒、副流感病毒以及腺病毒为对照，分析Cpn CpnF/CpnR引物的特异性。实验结果如图1所示，肺炎支原体、肺炎双球菌、流感病毒、副流感病毒以及腺病毒等均呈阴性，而肺炎衣原体呈阳性。由图2可知，熔解曲线峰单一，说明引物特异性高，无非特异产物出现。

图1 CpnF/CpnR引物的特异性分析Fig 1 The specificity analysis of CpnF/CpnR primer

图2 CpnF/CpnR引物的熔解曲线Fig 2 The melt curve of CpnF/CpnR primer

2.2 敏感性和线性范围

肺炎衣原体标品DNA以1∶5连续稀释6个浓度梯度后(200.0、40.0、8.0、1.6 ng·μl－1，320.0、64.0 pg·μl－1)作为PCR的模板，进行实时定量PCR扩增。扩增曲线如图3所示。

图3 不同浓度肺炎衣原体标准DNA扩增曲线Fig 3 The amplification curve of Cpn standard DNA of different concentrations

由图3可知，6个浓度的标准DNA模板均呈阳性，采用本方法可以测得的最低DNA浓度为64 pg·μl－1，当低于 64 pg·μl－1时扩增曲线的重复性较差，因此，该方法可以检测的线性范围为 64.0 pg·μl－1～200.0 ng·μl－1，模板浓度在此范围内可以进行精确的定量。

2.3 临床样本检测分析

分别对200例患者的咽拭子样本和68例患者的肺泡冲洗液样本进行了RT-PCR检测，同时与荧光免疫检测的结果进行比较，结果见表1。

表1 RT-PCR和免疫荧光法对咽拭子和肺泡冲洗液中肺炎衣原体的检出率比较Tab 1 The detection rate analysis of chlamydia pneumoniae between RT-PCR and immunofluorescence in clinical samples

如表1所示:RT-PCR对咽拭子和肺泡冲洗液中的Cpn阳性检出率分别为94.34%和84.61%，免疫荧光法的阳性检出率分别为83.02%和73.08%。RTPCR的检出率高于免疫荧光法。

3 讨 论

Cpn感染在呼吸道疾病的发生中占有很大的比例，目前临床上诊断的方法有细胞培养分离法、直接或间接免疫荧光法以及PCR法［6-7］。细胞培养法操作复杂，周期较长，分离效率较低，不适合临床快速检测［8］。抗体免疫荧光检测法是一种比较灵敏的方法，但是由于Cpn与沙眼衣原体之间存在抗原交叉反应，给诊断带来了一定的困难;同时Cpn IgM抗体一般在患者发病后1周后才能检测到，而且免疫系统发育不完全患者出现假阳性的比率较高［9］。多聚酶链反应在临床检测Cpn感染中也被广泛使用，但是该技术只能对Cpn感染作定性分析，无法定量［10］。

近年来，随着荧光定量PCR的问世，该技术迅速应用于临床诊断。荧光定量PCR具有可实时监测、准确性高、效率高等优点，并能降低PCR交叉污染问题。目前，常用的PCR定量方法有SYBR GreenⅠ随机参入法和TaqMan探针法。TaqMan探针法特异性更高，但是其成本较高［11］;SYBR GreenⅠ随机参入法无需探针，因此，成本低而且操作简单，适合于临床检测。我们针对Cpn 16S核糖体蛋白的保守序列设计了一对荧光定量PCR，通过特异性分析显示该引物具有极高的特异性，且在模板浓度 64.0 pg·μl－1～200.0 ng·μl－1范围内具有极好的线性，并比较了RT-PCR和免疫荧光法的阳性检出率，结果显示RT-PCR的阳性检出率高于免疫荧光法。本研究采用了200个咽拭子样本和68个肺泡冲洗液样本进行分析，通过大量的样本比较，增加了研究的准确性。综上所述，本实验成功建立了临床快速诊断Cpn的方法，灵敏度高且周期短，值得临床推广使用。

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