人CCR5基因真核表达质粒的构建及其鉴定

程林，宋红勇，吴喜林，吴稚伟

(南京大学医学院公共健康医学中心，江苏南京 210093)

CC型趋化因子受体5(CC chemokine receptor 5，CCR5)是G蛋白偶联受体超家族的成员，主要表达于T淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞等细胞膜上，是人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)入侵机体细胞的主要辅助受体之一，也是HIV-1水平传播和垂直传播的最主要的辅助受体。因此，以CCR5为靶点的HIV-1受体拮抗剂受到越来越多的关注［1］。本研究通过构建人CCR5真核表达质粒，为进一步的CCR5基因疫苗的研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

CHO-K1细胞和GHOST-X4细胞均为南京大学医学院公共健康医学中心保存，生长于含10%灭活胎牛血清(美国 Gibco公司)、2 mmol·L－1L-谷氨酰氨的DMEM培养基中。含人CCR5的原核表达质粒pETCCR5以及含荧光素酶(luciferase)报告基因的R5噬性HIV假病毒JR-FL均为本中心保存。高保真DNA聚合酶PrimeSTAR、T4 DNA连接酶和反转录试剂盒均购自大连Takara公司。核酸内切酶为美国Fermentas MBI公司产品。TRIzol试剂和转染试剂Lipofectamine 2000均购自美国Invitrogen公司。PE标记的鼠抗人CCR5单抗2D7为美国BD公司产品。去内毒素质粒中量提取试剂盒以及用于检测luciferase活性的细胞裂解液及底物均购自美国Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物的设计 根据 GenBank中人CCR5基因序列，用软件Oligo 6.0设计引物。上游引物加入HindⅢ限制性酶切位点和增强表达的Kozak序列［2］;下游引物均引入XhoⅠ限制性酶切位点。上游引物:5'-ACA GAA GCT TGGA TTA TCA AGT GTC-3'(实线为HindⅢ酶切位点，虚线示Kozak序列);下游引物:5'-GTGTCT CGA GTC ACA AGC CCA CAG ATA TTT CC-3'(实线示XhoⅠ酶切位点)。引物由上海Invitrogen生物有限公司合成。

1.2.2 PCR扩增人 CCR5基因 以原核表达质粒pET-CCR5为模板，PCR扩增人CCR5基因。反应条件为94℃变性4 min，然后 98℃ 10 s、60℃ 10 s、72℃ 80 s，扩增30个循环;最后72℃延伸5 min。产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.3 含CCR5基因重组真核表达质粒的构建与序列鉴定 用限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ双酶切1 μg真核表达质粒pcDNA3.1和纯化的PCR产物。酶切产物纯化后用 T4 DNA连接酶进行连接，并转化TOP10感受态细胞，37℃培养过夜。挑取氨苄青霉素平板上的菌落，扩增后通过核酸序列测定，选取100%同源的质粒命名为pcDNA3.1-CCR5。

1.2.4 RT-PCR检测 CCR5基因的转录 取2 μg重组质粒pcDNA3.1-CCR5，于6孔板内，按照试剂盒说明书转染CHO-K1细胞。阴性对照取2 μg pcDAN3.1载体质粒转染CHO-K1。转染48 h后，用TRIzol试剂裂解细胞，按试剂说明书提取基因组总RNA，取1 μg RNA为模板进行反转录合成cDNA。取1 μl cDNA为模板，PCR扩增CCR5基因，产物经过琼脂糖凝胶电泳鉴定［3］。

1.2.5 流式细胞术检测细胞膜CCR5蛋白表达 重组质粒pcDNA3.1-CCR5转染CHO-K1细胞48 h后，取2×105细胞，PBS洗涤后，用100 μl流式缓冲液重悬，加入2 μl抗人 CCR5荧光抗体，室温避光反应30 min，洗涤后用流式细胞仪检测。pcDAN3.1载体质粒转染CHO-K1作为阴性对照组。

1.2.6 HIV-1假病毒感染实验 96孔板中接种GHOST-X4细胞1×104孔－1，培养过夜后，转染重组质粒 pcDNA3.1-CCR5 0.2 μg·孔－1，48 h 后每孔加入200 TCID50的R5噬性HIV假病毒JR-FL，培养48 h后裂解细胞，检测luciferase活性。对照组转染载体质粒pcDNA3.1。每组设3个复孔，实验重复3次。

2 结 果

2.1 PCR扩增人CCR5基因

以质粒pET-CCR5为模板，PCR扩增人CCR5基因。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在大约1 000 bp的位置上出现目的条带(图1)。

图1 人CCR5基因的PCR扩增Fig 1 The agarose gel electrophoresis analysis of PCR product of human CCR5 gene

2.2 真核表达质粒pcDNA3.1-CCR5的序列鉴定

重组质粒pcDNA3.1-CCR5核酸序列测定结果显示，目的基因全长1 059 bp。Blast结果进一步表明，目的基因序列和GenBank中已经登记的人CCR5基因序列100%同源。以上结果表明，人CCR5基因被成功克隆到pcDNA3.1中。

2.3 CCR5基因在CHO-K1细胞中的表达

重组质粒 pcDNA3.1-CCR5转染 CHO-K1 48 h后，提取细胞总RNA，RT-PCR检测CCR5基因的转录，产物经琼脂糖凝胶电泳在大约1 000 bp的位置上出现目的条带(图2)，表明pcDNA3.1-CCR5已成功导入CHO-K1细胞内，并能正确转录合成mRNA。

图2 RT-PCR鉴定CCR5基因的转录Fig 2 RT-PCR analysis of CCR5 gene transcription

为了进一步鉴定该基因在蛋白水平的表达及膜定位情况，本研究用抗人CCR5蛋白的荧光抗体做流式分析，结果表明瞬时转染重组质粒pcDNA3.1-CCR5 48 h后，约25.6%的CHO-K1细胞表面表达CCR5蛋白(图3)。该结果进一步表明重组质粒pcDNA3.1-CCR5被成功导入CHO-K1细胞内，并得到正确的转录、翻译以及细胞膜定位。

图3 流式细胞术检测细胞膜表面CCR5蛋白Fig 3 Flow cytometry detection of cell surface CCR5 protein

2.4 膜表达CCR5能够介导R5噬性HIV假病毒的感染

HIV-1假病毒JR-FL感染被重组质粒pcDNA3.1-CCR5转染的 GHOST-X4细胞48 h后，实验组luciferase活性是对照组的200倍以上，经t检验，P=0.003 99(图4)，两组之间的差异有统计学意义。该实验结果表明，转染重组质粒pcDNA3.1-CCR5后，使GHOST-X4细胞具备了被R5噬性HIV-1假病毒感染的能力，进一步证实CCR5在GHOST-X4细胞内得到正确表达和细胞膜定位，而且具有介导R5噬性HIV-1假病毒感染的功能。

图4 荧光素酶活性检测Fig 4 Relative luciferase unit of JR-FL infected GHOSTX4 cells

3 讨 论

CCR5是β趋化因子(MIP-1α、MIP-1β和RANTES)的受体，主要表达于T淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞等的细胞膜上，具有调控T细胞和单核和(或)巨噬细胞的迁移、增殖等免疫的功能。CCR5具有7个跨膜 α螺旋，结构上分为:胞外N末端，3个胞外环(ECL1-3)，3个胞内环和胞内C末端。自1996年发现CCR5是HIV-1感染细胞的辅助受体以来，特别是在发现CCR5基因Δ32突变者在拥有正常的免疫功能和炎症反应的同时，还能够抵抗HIV-1的感染或抑制感染后疾病的进展之后［4］，以CCR5为靶点的HIV受体拮抗剂成为研究的热点，且取得了明显的进展，目前主要有以下4种CCR5拮抗剂:趋化因子衍生物、非肽类小分子化合物、肽类化合物和单克隆抗体［5］。

CCR5的膜外结构域包括N末端及3个胞外环，可为单克隆抗体提供多个抗原表位，而识别不同表位的单克隆抗体与CCR5结合后对R5噬性HIV病毒具有不同的抑制效应［6］。CCR5通过其N末端和ECL2与HIV gp120相互作用，推动膜融合过程，从而介导HIV感染细胞［7］。因此，识别CCR5 N末端和ECL2的抗体对R5病毒一般具有不同程度的中和作用。近期的研究发现，识别ECL1的抗体能够促CCR5内化，下调细胞表面CCR5的量，从而抑制R5噬性HIV的感染［8］。

尽管已有多种 CCR5单克隆抗体如 PRO140、mAb004以及2D7进入临床开发阶段［9］，但 CCR5单克隆抗体具有潜在的过敏反应，且长期使用易导致耐药毒株及中和抗-抗体等缺点。在HIV-1感染后长期不进展以及长期暴露而未被感染的人群中发现，针对CCR5 ECL1、具有抑制R5噬性HIV-1感染的自身抗体［10］。这些因素推动了 CCR5自身抗体的研究［11-12］。本研究构建了能够在真核细胞中正确表达、定位，且具有介导R5噬性HIV假病毒感染功能的人CCR5真核表达质粒，为进一步的基因疫苗的研究奠定基础。

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