重组人酸性成纤维细胞生长因子脂质体的制备及其物理稳定性评价

滕 跃，田海山，张 睿，焦 悦，李校堃

（1.吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程研究中心，吉林长春 130118；2.吉林农业大学生命科学学院，吉林 长春 130118；3.温州医学院，浙江 温州 325035）

重组人酸性成纤维细胞生长因子脂质体的制备及其物理稳定性评价

滕 跃1，2，田海山1，3，张 睿1，焦 悦1，李校堃1，3

（1.吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程研究中心，吉林长春 130118；2.吉林农业大学生命科学学院，吉林 长春 130118；3.温州医学院，浙江 温州 325035）

目的：确立重组人酸性成纤维细胞生长因子（rhaFGF）脂质体制备的最佳处方及工艺条件，研究其理化性质。方法：采用冻干再水化法，以磷脂与胆固醇质量之比、缓冲溶液pH值和均质时间为单因素，每个因素选取三水平进行实验，以药物包封率、物理稳定性和生物活性作为评价指标，确立优化脂质体制备的最佳处方及工艺条件。结果：采用最佳处方工艺条件，即磷脂与胆固醇的比例为20∶1，磷酸盐缓冲液pH值为6.5，高压均质时间为20min制备的rhaFGF脂质体，经测定其包封率（En）达81.79%±2.51%，物理稳定性参数（KE）为1.050%±0.342%，生物学活性为（6.521 0±0.617 1）×105U·mL－1，粒子大小较均匀，粒径大多分布在100nm左右。结论：通过优化工艺条件制备的rhaFGF脂质体包封率高，在4℃保存条件下，渗漏率低且具有很好的物理稳定性及生物学活性。

重组人酸性成纤维细胞生长因子；脂质体；包封率；渗漏率

成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factors，FGF）是一个多肽类生长因子家族，现已发现24个成员，重组人酸性成纤维细胞生长因子（recombinant human acidic fibroblast growth factor，rhaFGF）为成纤维细胞生长因子家族中的一员。作为一个高度保守的功能蛋白，rhaFGF不但具有促进创伤愈合、神经组织修复以及胚胎发育与分化等方面的作用，而且还具有舒张血管、缺血保护、促血管内皮细胞及平滑肌细胞增殖、分化和迁移作用［1－2］。研究结 果［3－6］表 明：rhaFGF 在心脏缺血和冠心病中对新生血管形成过程中的多个环节，如毛细血管基底膜降解、胶原合成和小血管腔形成等均有明显促进作用，而冠心病的发生与上述因素的抑制和异常存在着密切的关系。rhaFGF作为一种蛋白类药物与传统的药物相比具有用药剂量小、疗效好、毒副作用低等突出优点，但是其体内外的不稳定性以及蛋白类药物半衰期短、清除率高，易受体内酶和体液的破坏等因素限制了多肽、蛋白类药物的应用［7］。因此，找到一种安全、有效和稳定的转运蛋白类药物的给药系统是目前生物技术药物所面临的一个重大难题。

脂质体（liposome）是一种将药物包封于类脂双分子层中所形成的超微型球状载体制剂，是一种定向药物载体，属于靶向给药系统。由Bangham于20世纪60年代中期提出，迄今已广泛应用于生物化学、生物物理学等各种科学领域，并且脂质体作为药 物 传 递 系 统 已 广 泛 应 用 于 临 床［8－10］。自Gregoriadis等利用脂质体作为药物载体以来，脂质体作为一种新型的药物载体的研究与应用迅速发展，脂质体载药技术日趋成熟。因此本文作者确立了rhaFGF脂质体制备的最佳处方及工艺条件，以期为冠心病的治疗开辟一条新途径。

1 材料与方法

1.1 实验材料

rhaFGF原液（本实验室制备并保存）；德固赛大豆磷脂（SPC，德国嘉吉公司）；胆固醇（北京鼎国生物技术有限公司）；NIH 3T3细胞（本实验室保存）；化学试剂均为国产分析纯。

1.2 实验仪器

冷冻干燥机（VirTis公司）；低温高速离心机（BECKMAN COULTER Avanti J－26XP）；扫描电子显微镜S－3400N（日本，日立公司）；激光粒度分析仪；KQ－250DB型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；ZFQ 85A型旋转蒸发仪；AH－100高压均质机（加拿大，ATS公司）；S20K pH指示剂（德国，梅特勒公司）；PLUS384酶标仪（美国，美国分子生物公司）；Waters型高效液相色谱仪（美国，Waters公司）；色谱柱DiamonsiTM （钻 石）C18，5 μm，250mm×4.6mm（Dikma公司）。

1.3 rhaFGF脂质体的制备及鉴定

1.3.1 rhaFGF脂质体的制备 用冻干再水化法制备脂质体（FRV）。精密称取大豆卵磷脂1.00g与胆固醇0.05g，溶于50mL三氯甲烷中，超声震荡10min后，加入75mL乙醚与25mL三氯甲烷（此过程处于超声震源处并需防止水溅入，注意封口防止挥发），滴加0.02mol·L－1、pH7.0的磷酸盐缓冲溶液50mL，超声至不分层，形成乳白色油包水化体后进行旋转蒸发，蒸发过程中相变，变成水包油，即得脂质体。随后在1 200～1 500bar条件下高压均质15～30min，依次采用1.00、0.60、0.45、0.22 μm 滤 膜 进 行 整 粒， 加 入rhaFGF于37℃孵育15min后加入附形剂混合分装，－40℃预冻2h，冷冻干燥24h后4℃、25℃、37℃保存，使用时加注射用水水化即得rhaFGF脂质体。

1.3.2 SDS－PAGE电泳－银染法对rhaFGF脂质体进行鉴定 精密吸取rhaFGF脂质体样品100μL，加入过量的NaCl，振摇后，加入氯仿300μL振摇混合均匀，8 000r·min－1离心分离10min，取上清液，PB（pH6.5）稀释10倍，加入相同体积的上样缓冲液，沸水浴加热10min，12 000r·min－1离心分离10min。用微量进样器吸取20μL上样，同时加蛋白Marker、空白脂质体和rhaFGF原液作为对照。

1.3.3 脂质体制备工艺优化 通过单因素考察对脂质体处方进行优化，A：磷脂与胆固醇质量之比；B：磷酸盐缓冲溶液pH值；C：高压均质机均质时间。经单因素实验预试，选取影响包封率因素，每个因素选取三水平进行实验，以药物包封率、物理稳定性和生物活性作为评价指标。

1.4 脂质体的评价方法

1.4.1 形态学及粒径分布 采用扫描电镜对rhaFGF脂质体样品形态学观察。取rhaFGF脂质体样品滴加于样品台上，干燥完全后抽真空达4Pa，调节放电电压（1 200～1 400V），电流5～6mA进行镀膜，厚度约10nm。将样品放入扫描电镜中，抽真空为5×10－3Pa，调节电镜的加速电压、工作电流及工作距离，对样品进行观察。先在低放大倍数下对电镜进行粗略的聚焦，然后调整样品位置，调高放大倍数直到样品形态清晰，迅速聚焦并照相。采用激光散射法进行脂质体粒度的分析。首先用蒸馏水将激光粒度分析仪调零调平后，使用微量进样器取10mL rhaFGF脂质体样品缓慢加入到进样口中，等待激光粒度分析仪检测粒径大小及粒度分布情况并制图。

1.4.2 包封率（En）的测定 取2mL rhaFGF脂质体样品置于10mL定量瓶中，用二甲亚砜定溶，再以95%乙醇稀释10倍，摇匀，用HPLC定量。按下式计算包封率：En（%）＝（We／Wt）×100%，其中We和Wt分别代表被包封入脂质体中的rhaFGF量和总rhaFGF量。

1.4.3 稳定性的测定 采用离心－分光光度法测定物理稳定性参数（KE），精密吸取rhaFGF脂质体样品1mL，置离心管中3 200r·min－1离心10min，取离心前的脂质体及离心后的上清液各0.3mL，分 别 加 磷 酸 盐 缓 冲 液 （pH 6.5，0.02mol·L－1）稀释至5.0mL，以磷酸盐缓冲液为空白，于波长280nm处测定吸光度（脂质体离心前后测得的吸光度值分别为A0和A），计算物理稳定性参数KE值。KE＝（A0－A）／A0×100%，KE值越小，说明脂质体越稳定。

1.4.4 脂质体渗漏率测定 采用SephadeX G－50分子排阻色谱法将载药脂质体与游离药物分开，再将载药脂质体混悬液分别置于4℃、25℃、37℃保存，间隔一定的时间用HPLC方法测定药物渗漏率（Q渗）。Q渗（%）＝（放置前介质中的药物量－放置后介质中的药量）／制剂中药量×100%。

1.4.5 生物活性的测定 采用 MTT法测定［11］rhaFGF脂质体和rhaFGF原液。用含0.5%血清的DMEM培养液稀释至0.1mg·L－1，精密吸取100μL加入第1孔，依次4倍稀释，每个稀释度设2个复孔；rhaFGF标准品初始计量为100U，并设空白脂质体基质对照，在酶标仪上以630nm为参比波长，于波长570nm处测定A值，计算rhaFGF脂质体的生物学活性。

2 结 果

2.1 rhaFGF脂质体鉴定

采用SDS－PAGE电泳－银染法对rhaFGF脂质体进行鉴定，空白脂质体泳道中未见rhaFGF条带，rhaFGF脂质体泳道中在与rhaFGF原液的泳道的相同位置有相应的条带。见图1。

图1 SDS－PAGE法测定rhaFGF脂质体Fig.1 rhaFGF liposomes measured by SDS－PAGE

2.2 处方优化实验结果

以En、KE和生物活性为指标，采用单因素考察方法运用冻干再水化法制备的rhaFGF脂质体样品。以最佳处方工艺条件：即磷脂与胆固醇的比例为20∶1，磷酸盐缓冲液pH值为6.5，高压均质时间为20min制备的rhaFGF脂质体，经测定其En达 （81.79 ± 2.51）%， KE为 （1.05 ±0.342）%，生物活性效价为 （6.521±0.617）×105U·mL－1。见表1～3。

2.3 rhaFGF脂质体形态学及粒径分布

扫描电镜观察：rhaFGF脂质体形状较规则，呈现圆球形或椭圆球形囊泡；粒子大小较均匀，粒径范围约在100nm （图2）。

表1 不同磷酸和胆固醇比例组脂质体En、KE和生物活性的变化Tab.1 Changes of En，KEand bioactivity of rhaFGF liposomes in phospholipid and cholesterol with different ratios groups （n＝4，±s）

表1 不同磷酸和胆固醇比例组脂质体En、KE和生物活性的变化Tab.1 Changes of En，KEand bioactivity of rhaFGF liposomes in phospholipid and cholesterol with different ratios groups （n＝4，±s）

SPC∶Chol En（η／%） KE（η／%） Bioactivity（λB／×105 U）10∶1 65.81±4.51 0.88±0.35 6.52±0.69 20∶1 80.79±3.66 0.96±0.67 7.02±0.80 30∶1 78.90±1.93 1.00±0.24 7.24±0.17

表2 不同pH值组脂质体En、KE和生物活性的变化Tab.2 Changes of En，KEand bioactivity of rhaFGF liposomes in different PH values groups （n＝4，±s）

表2 不同pH值组脂质体En、KE和生物活性的变化Tab.2 Changes of En，KEand bioactivity of rhaFGF liposomes in different PH values groups （n＝4，±s）

pH En（η／%） KE（η／%） Bioactivity（λB／×105 U）6.0 70.66±8.51 0.97±0.30 6.52±0.69 6.5 78.79±4.73 0.94±0.61 7.56±0.21 7.0 79.24±4.97 1.04±0.69 6.02±0.58

表3 不同粒径分布组脂质体En、KE和生物活性的变化Tab.3 Changes of En，KEand bioactivity of rhaFGF liposomes in different particle size distribution groups（n＝4，±s）

表3 不同粒径分布组脂质体En、KE和生物活性的变化Tab.3 Changes of En，KEand bioactivity of rhaFGF liposomes in different particle size distribution groups（n＝4，±s）

Time（t／min） En（η／%） KE（η／%） Bioactivity（λB／×105 U）15 75.81±4.51 0.99±0.29 6.82±0.25 20 82.41±3.27 0.88±0.26 7.92±0.89 30 82.90±6.39 0.83±0.79 4.24±0.93

图2 rhaFGF脂质体扫描电镜观察结果Fig.2 The observation results of rhaFGF liposome by scanning electron microscope

2.4 稳定性考察

分别测定rhaFGF脂质体在4℃、25℃和37℃条件下保存30d后的En、KE、Q渗及生物活性的变化情况。结果表明：本实验制备的rhaFGF脂质体在4℃条件下较为稳定，En、KE及生物学活性变化不大，而在25℃和37℃条件下不易稳定存在。见表4。

图3 rhaFGF脂质体平均粒径分布Fig.3 Average particle size distribution of rhaFGF liposome

2.5 生物活性的测定

采用MTT法测定rhaFGF脂质体的生物活性，结果见图4。由图中可见：rhaFGF脂质体样品对NIH 3T3细胞有促增殖作用，且与aFGF标准品生物学活性基本一致。

表4 不同温度下脂质体En、KE、Q渗和生物活性的变化Tab.4 Changes of En，KE，Q，and bioactivity of rhaFGF liposomes at different temperatures （n＝4，±s）

表4 不同温度下脂质体En、KE、Q渗和生物活性的变化Tab.4 Changes of En，KE，Q，and bioactivity of rhaFGF liposomes at different temperatures （n＝4，±s）

“－”：No data.

T（θ／℃） En（η／%） KE（η／%） Q（η／%） Bioactivity（λB／×105 U）4 71.16±0.97 2.87±0.08 8.2±1.2 7.92±0.89 25 61.84±0.53 9.98±0.36 20.8±3.1 6.93±0.88 37 45.58±1.89 21.58±0.75 35.6±4.6—

图4 各组NIH 3T3细胞生物活性的变化Fig.4 Changes of bioactivities of NIH 3T3cells in various groups

3 讨 论

多肽、蛋白类药物大多为内源性物质，这些活性蛋白在体内含量极微，但参与和调控许多重要的生理学功能，针对性强、效果显著，特别是在治疗和预防严重威胁生命的疾病方面发挥愈来愈重要的作用。但这些物质一般稳定性较差，易在酸碱环境中被破坏或在体内酶解。另外，此类药物在体内生物半衰期短，给药后在血中消除很快，难以充分发挥其应有的药理作用［11－12］。

脂质体作为一种新型的药物传递系统，具有以下优势：①增强多肽、蛋白类药物体内外的稳定性的作用；②包裹多肽、蛋白类药物在体内延缓释放，可延长药物的半衰期；③用于多肽、蛋白类药物的载体，可以实现药物的靶向给药；④局部运用可增加药物与局部组织的亲和性，减少刺激［13］。这些优点为多肽、蛋白质类药物应用，尤其在稳定性、延长体内半衰期及靶向给药领域发挥着越来越大的作用，有着广阔的应用前景。做为新型药物载体，随着在材料、制备方法、制备工艺、给药途径等方面逐步走向完善，为该类药物制剂的产业化生产奠定了良好的基础。

本实验通过优化工艺条件制备的rhaFGF脂质体包封率较高，且具有很好的物理稳定性及生物学活性。本课题组将在本次实验的基础上，进一步研究rhaFGF脂质体注射体内后，其稳定性、半衰期及药物释放度，并进一步研究其对心肌缺血性冠心病的治疗效果。

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Preparation of rhaFGF liposomes and evaluation of their physical stability

TENG Yue1，2，TIAN Hai－shan1，3，ZHANG Rui1，JIAO Yue1，LI Xiao－kun1，3
（1.Engineering Research Center of Bioreactor and Pharmaceutical Development，Ministry of Education，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；2.College of Life Science，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；3.Wenzhou Medical College，Wenzhou 325035，China）

Objective To optimize the prescription and preparation of recombinant human acidic fibroblast growth factor（rhaFGF）liposomes，and to study the physical and chemical properties.Methods The encapsulation efficiency and biological activity of rhaFGF liposomes were evaluated by single factor test.Freeze－drying－rehydration was used to obtain the optimum prescription and preparation of rhaFGF liposomes.Results The encapsulation efficiency of rhaFGF liposomes was（81.79±2.51）%，the physical stability index（KE）was（1.050±0.342）%and the bioactivity was（6.521 0±0.617 1）×105U·mL－1.The particle size was about 100nm uniformly.Conclusion The preparation of rhaFGF liposomes is optimized，and these liposomes have high encapsulation efficiency，good physical stability and high bioactivity at 4℃.

recombinant human acidic fibroblast growth factor；liposome；encapsulation efficiency；percolation ratio

R94

A

1671－587Ⅹ（2012）05－0932－05

2012－04－24

吉林省教育厅科研基金资助课题 ［2009（65）］

滕 跃 （1985－），女，内蒙古自治区突泉县人，在读生物化学与分子生物学硕士，主要从事基因工程制药的研究。

田海山 （Tel：0577－86689983，E－mail：tianhaishan332＠sina.com）；李校堃 （Tel：0431－84533348，E－mail：xiaokunli＠163.net）