HPLC法测定清热通淋片中苦参碱和氧化苦参碱含量方法的建立及评价

孙 录，史 磊，吕 薇，耿 虹，王 华

（1.吉林大学中日联谊医院药剂科，吉林 长春 130033；2.吉林大学第二医院药剂科，吉林 长春 130041；3.吉林省食品药品检验所，吉林 长春 130033）

HPLC法测定清热通淋片中苦参碱和氧化苦参碱含量方法的建立及评价

孙 录1，史 磊2，吕 薇1，耿 虹3，王 华1

（1.吉林大学中日联谊医院药剂科，吉林 长春 130033；2.吉林大学第二医院药剂科，吉林 长春 130041；3.吉林省食品药品检验所，吉林 长春 130033）

目的：建立高效液相色谱（HPLC）法测定清热通淋片中苦参碱和氧化苦参碱含量的新方法，优化清热通淋片质量的检测和控制。方法：采用HPLC法。以苦参碱、氧化苦参碱标准品为对照品，清热通淋片为样品。使用Agilent 1200高效液相色谱仪，色谱柱Genimi－C18（5μm，4.6mm×250mm），流动相为磷酸盐缓冲液（pH＝3.0）－甲醇（93∶7），流速为0.8mL·min－1，柱温为35℃，检测波长为220nm，进样量为10μL。通过对HPLC法进行线性关系、专属性、稳定性、精密度、重复性和准确度试验以进行方法学考察。结果：苦参碱回归方程为Y＝1 102.1X＋15.423，其进样量在0.311 8～4.677 0μg范围内呈良好线性关系（r＝0.999 9），平均加样回收率为97.1%，RSD＝0.24%（n＝6）；氧化苦参碱回归方程为 Y＝1 106.6X＋5.040 2，其进样量在0.029 8～0.446 4μg范围内呈线性关系（r＝0.999 6），平均加样回收率为98.4%，RSD＝1.52% （n＝6）。在稳定性、精密度和重复性实验中，苦参碱和氧化苦参碱的RSD值分别为1.21%、1.47% ；0.13%、2.76%；0.48%（苦参碱和氧化苦参碱之和的RSD）。结论：HPLC方法分离效果好、专属性强、简便、灵敏和准确，可作为清热通淋片中苦参碱和氧化苦参碱含量的测定方法。

高效液相色谱法；清热通淋片；苦参碱；氧化苦参碱

清热通淋片 （Qingre Tonglin Tablet，QRTLT）是由爵床、白茅根、苦参、硼砂等4味药材组成，具有清热、利湿、通淋的功效。苦参为主药，具有清热燥湿、杀虫消炎利尿的功效［1］。苦参中含有苦参碱和氧化苦参碱等生物碱［2－3］，在心脑血管系统、抗肿瘤等方面有重要的药理活性［4］。原标准和文献［5］只测定苦参碱的含量，未见同时测定苦参碱和氧化苦参碱控制QRTLT质量的报道，QRTLT在制备过程中，由于苦参粉末和煎煮入药的工艺不同，苦参碱和氧化苦参碱的含量也有变化，本实验根据QRTLT制法及工艺特点，参考相关文献［6－9］采用高效液相色谱（HPLC）法建立了氧化苦参碱的含量测定方法，改进了苦参碱的含量测定方法，并将原标准中仅测定苦参碱修订为测定苦参碱和氧化苦参碱的总和计算含量，使样品的含量测定更为合理。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂

Agilent 1200高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；MILL－Q纯水处理器 、CQX－12型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。苦参碱对照品（批号为110805－200306）和氧化苦参碱对照品（批号为110780－200506）均为中国药品生物质品检定所提供，供含量测定用；甲醇为色谱纯；水为超纯水；其他试剂为分析纯；QRTLT（批号为2010101，2010102，20100501）为江西杏林白马药业有限公司提供。

1.2 色谱条件

色 谱 柱：Genimi－C18 （5 μm，4.6mm ×250mm ），以 磷 酸 盐 缓 冲 液 （pH 3.0）－甲 醇（93∶7）为流动相，检测波长为220nm，流速0.8mL·min－1，柱温35℃，进样量10μL。

1.3 溶液的制备

1.3.1 对照品溶液的制备 精密称取苦参碱对照品15mg、氧化苦参碱对照品8mg，分别置于10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再各精密量取5mL，分别置于25mL量瓶中，用磷酸缓冲液（pH 3.0）稀释至刻度，摇匀，即得。

1.3.2 供试品溶液的制备 取 QRTLT粉末1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入三氯甲烷50mL，浓氨试液1mL，密塞，称定质量，放置过夜，超声处理（功率250W，频率33kHz）30min，再称定质量，用三氯甲烷补足其减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25mL，回收溶剂至干，立即取下，残渣加甲醇1mL使其溶解，转移至10mL量瓶中，加磷酸盐缓冲液（pH 3.0）至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.3.3 阴性样品对照液的制备 按处方比例，取除苦参外的其余药味，按工艺要求制成不含苦参的阴性样品，再按1.3.2中的方法制成阴性样品对照液。

2 结 果

2.1 专属性试验

精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品对照液各10μL，分别注入液相色谱仪测定，分别测得色谱图（图1），结果供试品色谱中，在与苦参碱和氧化苦参碱对照品色谱峰相应的位置上有相应的色谱峰，而阴性样品在与对照品色谱峰相应的位置上无色谱峰出现，说明阴性样品无干扰。

2.2 线性关系考察

2.2.1 苦参碱 精密称取苦参碱对照品适量，加流动相制成每1mL含0.311 8mg的溶液，分别精密吸取1、3、5、10和15μL测定，以峰面积（Y）对苦参碱浓度（X）进行线性回归，得回归方程Y＝1 102.1X＋15.423（r＝0.999 9，n＝6），结果表明：苦参碱进样量在0.311 8～4.677 0μg范围内，呈良好线性关系，符合外标法定量测定的要求。

图1 HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

2.2.2 氧化苦参碱 精密称取氧化苦参碱对照品适量，加流动相制成每1mL含0.029 76mg的溶液，分别精密吸取1、3、5、10和15μL测定，以峰面积 （Y）对苦参碱浓度 （X）进行线性回归，得回归方程 Y＝1 106.6X＋5.040 2（r＝0.999 6，n＝6），结果表明：苦参碱进样量在0.029 8～0.446 4μg范围内，呈线性关系，符合外标法定量测定的要求。

2.3 稳定性试验

精密吸取供试品溶液10μL，在0、2、4、6、9及12h测定苦参碱和氧化苦参碱峰面积值，结果苦参碱的相对标准差 （relative standard deviation，RSD）为1.21%，氧化苦参碱RSD＝1.47% （n＝6），表明供试品溶液在12h内稳定性良好。

2.4 精密度试验

精密吸取供试品溶液10μL，按上述色谱条件，连续测定6次，结果其中苦参碱RSD为0.13%，氧化苦参碱 RSD为2.76% （n＝6），表明仪器的精密度良好。

2.5 重复性试验

按1.3.2项下方法平行制备6份供试品溶液，分别取10μL进样测定，结果氧化苦参碱和苦参碱之和的平均含量为1.1mg／片 （RSD ＝0.48%，n＝6），表明本法的重复性良好。

2.6 准确度试验

2.6.1 苦参碱 取QRTLT （苦参碱的含量为2.681mg·g－1）0.5g共6份，精密称定，置于已经分别精密加入对照品溶液 （0.311 8g·L－1）2.1mL （挥干溶剂）的具塞锥形瓶中，按1.3.2项下方法制成6份供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，计算加样回收率，符合定量分析的要求。见表1。

表1 苦参碱回收率试验结果Tab.1 Results of recovery rate test of matrine （n＝6）

2.6.2 氧化苦参碱 取QRTLT （氧化苦参碱的含量为0.261mg·g－1）0.5g共6份，精密称定，置已分别精密加入对照品溶液 （0.029 76g·L－1）2.5mL （挥干溶剂）的具塞锥形瓶中，按1.3.2项下方法制成6份供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，计算加样回收率，符合定量分析的要求。结果见表2。

2.7 样品测定

按上述色谱条件和含量测定方法，精密测定3批样品，记录峰面积，计算每片含量。见表3。

表2 氧化苦参碱回收率试验结果Tab.2 Results of recovery rate test of oxymatrine （n＝6）

表3 样品含量测定结果Tab.3 Results of content determination of samples（m／mg）

3 讨 论

3.1 检测波长的选择

取苦参碱和氧化苦参碱对照品溶液分别测定其紫外吸收光谱，根据其最大吸收波长，同时参考文献［10－12］，并考虑测定时样品的稳定性，故选定检测波长为220nm。在选定条件下，苦参碱与氧化苦参碱和样品中其他组分色谱峰可基线分离。

3.2 流动相的选择

①乙腈－0.1%磷酸二氢钾溶液 （每1 000mL含磷酸1.6mL，三乙胺0.4mL） （3∶97） （原QRTLT含量测定用流动相）；②乙腈－水 （6.80g的磷酸二氢钾＋1.01g的庚烷磺酸钠→1 000mL水中，三乙胺pH值调至7.0） （18∶82） （原QRTL胶囊含量测定用流动相）；③磷酸盐缓冲液（pH3.0）－甲醇 （93∶7）为流动相。磷酸盐缓冲液制法：取3.402g磷酸二氢钾溶解于1L超纯水中，用磷酸调pH至3.0。结果表明：使用流动相③平衡时间最短，分离效果最好；使用流动相①、②也可使供试品溶液较好分离，但三乙胺对色谱柱损害较大，会降低色谱柱的使用寿命。

3.3 供试品提取纯化条件的选择

根据苦参碱和氧化苦参碱的溶解性能，并参考有关文献［13－14］采用了4种方法进行提取纯化。最终选取如下方法：取本品粉末1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入三氯甲烷50mL，浓氨试液1mL，密塞，称定质量，放置过夜，再进行超声处理。因为放置过夜后制备的供试品含量高于未放置过夜、直接超声或回流提取的供试品，而且超声的方法比回流法更为简便，故采取 “放置过夜、再超声处理”的供试品溶液的制备方法。

本实验根据QRTLT制法及工艺特点 （苦参三分之二粉碎，三分之一水煎煮入药，粉末中含氧化苦参碱的较多），改进了含量测定方法，并将原标准中仅以苦参碱计算含量，修订为以苦参碱和氧化苦参碱的总和计算，使样品的含量测定更为合理。根据QRTLT制法、工艺、处方量及制成量，暂定为本品每片含苦参碱和氧化苦参碱的总量不得少于1.0mg。本方法可以较好地实现QRTLT的质量控制。

［1］江苏新医学院.中药大辞典 （上册）［M］.上海：上海科学技术出版社，1986：1283.

［2］全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编 （上册）［M］.北京：人民卫生出版社，1996：529.

［3］王 宇.苦参化学、工艺、制剂及质量研究近况 ［J］.中成药，1997，19 （4）：39.

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［13］国家药典委员会.中华人民共和国药典 （一部） ［S］.2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：188，915.

［14］胡森科，于 燕，苗江丽.治带片中苦参碱及氧化苦参碱的HPLC法测定 ［J］.西安交通大学学报：医学版，2007，28 （3）：343－345.

Establishment and evaluation of HPLC method to determine content of matrine and oxymatrine in Qingre Tonglin Tablet

SUN Lu1，SHI Lei2，LV Wei1，GENG Hong3，WANG Hua1
（1.Department of Pharmacy，China－Japan Union Hospital，Jilin University，Changchun 130033，China；2.Department of Pharmacy，Second Hospital，Jilin University，Changchun 130041，China；3.Jilin Institute for Food ＆Drug Control，Changchun 130033，China）

Objective To establish a new method to determine the contents of matrine and oxymatrine in Qingre Tonglin Tablet by high performance liquid chromatography（HPLC），in order to optimize the quality evaluation and control of Qingre Tonglin Tablet.Methods HPLC method was adopted.Matrine and oxymatrine standards were the control substances and Qingre Tonglin Tablets were the experiment samples.Using Agilent 1200high performance liquid chromatograph，the determination was performed on Genimi－C18（5μm，4.6mm×250mm）column with mobile phase consisting of phosphate buffer solution（PH3.0）－methanol（93∶7）at the flow rate of 0.8mL·min－1.The column temperature was 35℃.The detection wavelength was 220nm and the injection volume was 10μL.For the methodological study，the linearity，specificity，stability，precision and repeatability and accuracy of the HPLC method were tested.Results The regression equation of matrine was Y＝1102.1X＋15.423，showing good linearity（r＝0.999 9）in the range of 0.311 8－4.677 0μg.the average recovery rate was 97.1% （RSD＝0.24%，n＝6）.The regression equation of oxymatrine was Y＝1106.6X＋5.040 2，showing good linearity （r＝0.999 6）in the range of 0.029 8－0.446 4μg；the average recovery rate was 98.4%（RSD＝1.52%，n＝6）.In the tests of stability，precision and repeatability，the RSD of matrine and oxymatrine were respectively 1.21%，1.47%；0.13%，2.76%；0.48% （RSD of the sum of matrine and oxymatrine）.Conclusion HPLC method is simple，sensitive，reliable，specific and has satisfactory separation results，and it is competent for the quality control of Qingre Tonglin Tablet.

high performance liquid chromatography；Qingre Tonglin Tablet；matrine；oxymatrine

R927.2；R284.1

A

1671－587Ⅹ（2012）05－0894－05

2012－06－13

吉林省科技厅科技发展计划项目资助课题 （200705288）

孙 录 （1958－），男，吉林省榆树市人，副主任药师，主要从事医院药学研究。

孙 录 （Tel：0431－84997594，E－mail：sunlugood＠163.com）