成都地区鸭疫里默氏杆菌的分离与鉴定

李建臻，杨 苗，吴永胜，曹雨辰，许祯莹，孙越鸿

（1.成都市农林科学院畜牧研究所，四川 成都 611134；2.四川省出入境检验检疫局技术中心，四川 成都 610041）

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 自2009年10月～2011年6月，从成都所辖双流、大邑、邛崃、崇州、新津、金堂等6市（县）不同的养殖场收集出现神经症状，以及有纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎及脑膜炎病变的病死鸭，取其脑、心血、肝脏作为病料，分离细菌待检。

1.1.2 试剂 培养基:巧克力琼脂平板、鲜血琼脂平板均参照微生物学实验教程（姚火春，2001）自制，麦康凯琼脂培养基（MACC）与肠杆菌科细菌生化常规鉴定管购自杭州天和微生物试剂有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs、蛋白酶K、RNase酶、PCR反应缓冲体系，琼脂糖，溴化乙锭，6×Glycerol DNA Loading Buffer，均为TaKaRa公司产品；其他化学试剂如氯仿、异丙醇、乙醇、NaCl等，均为国产分析纯产品。

1.1.3 参考菌株 RA-JX阳性菌株（1型），抗RA的1型血清以及大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌，均由成都市农业职业科技学院动物传染病研究室提供。

1.2 方法

1.2.1 鸭疫里默氏杆菌（RA）的分离培养 对疑似RA的病鸭、死鸭进行逐一剖检，详细记录其日龄和病理变化。分别无菌从病鸭、死鸭的脑、肝脏和心脏采样划线接种于兔鲜血琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基，将兔鲜血琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基一起置于37℃温箱中培养24～48 h，观察细菌的生长情况。挑取只在兔鲜血琼脂培养基上生长而不在麦康凯琼脂培养基上生长的圆形、稍突起、表面光滑、透明的菌落，用兔鲜血琼脂培养基进行纯培养。再将纯培养物进行革兰氏染色，光学显微镜下观察细菌的形态和染色特性。

1.2.2 细菌生化试验 用分离出的纯培养物分别作生化试验，置37℃恒温箱中培养72 h，每天观察并记录结果一次。

1.2.3 PCR试验 鸭疫里默氏杆菌的PCR鉴定:参照杨苗等的方法进行，细菌DNA模板提取采用热裂解方法。以热裂解方法提取的细菌DNA为模板，针对16SrRNA的特异基因序列设计合成引物（由大连宝生物工程公司合成），然后进行PCR扩增，引物扩增的目的带片段大小为844bp左右，用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳（80V，40min）EB染色，紫外线下观察、拍照，分析PCR扩增产物。

1.2.4 血清型鉴定 参照杨宗维等的方法采用玻片凝集法对分离菌株进行血清型鉴定。方法如下：取25μL灭菌生理盐水于灭菌的EP管中，用灭菌接种环轻轻挑取菌株的纯培养物移入EP管并充分摇匀，以调整至1×109CFU/mL浓度的悬液作为抗原；分别取25μL抗原与25μL抗血清在玻片上混合均匀，室温静置，3min内判定并记录结果；如3min内出现颗粒状凝集者，则记为阳性（+），不出现凝集者记为阴性（-）；同时将RA的血清I型参考菌株抗原设为阳性对照，以大肠杆菌、沙门氏杆菌、PBS液为阴性对照。

2 结果

2.1 分离株的菌体形态和菌落培养特征 将RA疑似分离株接种到兔鲜血琼脂培养基上培养48h后，长出表面光滑、微突起、圆形、闪光透明、奶油状、直径为0.5～2.0mm的菌落，在麦康凯平板上不生长；分离菌株经革兰氏染色证实为革兰氏阴性无芽孢小杆菌，常单个存在，偶尔呈链状排列。结果共得到此类细菌17株。

2.2 生化试验结果 17株RA分离物均不能发酵糖，皆能液化明胶（+），17株BS-RA分离物对鸟氨酸脱羧酶和精氨酸双水解酶分解都表现为阳性，其余各项全为阴性，基本符合RA的特征（见表1）。

2.2 PCR试验结果 17株RA分离菌株皆扩增出844bp的目的条带，而作为对照的大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌参考菌株均为阴性，详见图1。

表1 RA分离菌株的生化反应结果 株、%

图1 PCR方法对RA分离株的检测结果

2.3 血清型鉴定结果 将经细菌学检查、生化试验、PCR鉴定为RA的17株细菌分别编号SL1、SL2、SL3（来自成都双流），DY1、DY2、DY3（来自成都大邑），QL1、QL2、QL3、QL4、QL5 （来自邛崃），CZ1、CZ2、CZ3（来自崇州），XJ1、XJ2（来自新津），JT（来自金堂），结果显示：10个分离菌株均与RA 1型阳性血清发生阳性反应（SL1、SL2、SL3、DY1、DY2、QL1、QL3、QL4、CZ2、XJ2），其余7株因条件限制，未作进一步鉴定。

3 结论与分析

3.1 从成都所辖双流、大邑、邛崃、崇州、新津、金堂等6个县（市）的20个养殖场共69羽RA疑似病例中分离得到了17株细菌，经过病料触片染色、细菌分离培养、生化反应鉴定、PCR技术鉴定等诊断为鸭疫里默氏杆菌感染。其中PCR检测技术的发展为快速诊断疾病提供了便利，试验中RA菌样扩增出了目的条带，而大肠杆菌、巴氏杆菌菌样均未扩增出条带，说明该方法具有特异性。利用PCR技术进行诊断既能保证准确率，又节省了时间。

3.2 用血清1型RA参考菌株标准阳性血清对所有分离株进行玻片凝集试验，结果10个分离菌株均与RA 1型阳性血清发生阳性反应，其余7株未定型。17株RA分离株中，有10株为血清1型，占总分离株的58.8%，表明成都地区鸭疫里默氏杆菌流行以血清1型为主，但至少存在两种不同的血清型，这与大多数学者的研究结果相符。同时提示我们，该病有多种血清型混合流行，防治难度有所增加，尤其是用单一菌种疫苗防治该病颇有难度。

[1]杨 苗，程安春.基于鸭疫里默氏杆菌16SrRIVA PCR检测方法的建立和应用 [J].四川农业大学学报，2007，25（3）：343-347.

[2]杨平东，黄 伟，李 鑫，等.广东、四川省和重庆地区鸭传染性浆膜炎流行病学调查 [J].畜牧市场，2010，（5）：21-22.

[3]杨宗维，韦 平，周 祥，等.南宁市商业肉鸭鸭疫里默氏杆菌病的调查研究[J].广西农业生物科学，2006，25（3）：210-214.