酶联免疫法测定猪肉中磺胺类药物的残留

冯才伟 ，朱君红 ，王会玲 ，罗晓琴 ，崔廷婷

（1.北京勤邦生物技术有限公司，北京 102206；2.河南众品食业股份有限公司，河南 长葛 461500）

目前，对动物源性食品中磺胺类药物的残留分析主要采用微生物法、理化法（HPLC、GC-MS、LC-MS/MS等）和免疫法（酶联免疫法、免疫层析法等）。酶联免疫法作为一种快速筛选方法，具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，适用于现场监控和大量样本的筛查，目前已在农药、兽药残留检测中得到广泛应用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本与试剂 猪肉：市售；磺胺“十五合一”ELISA检测试剂盒：北京勤邦生物技术有限公司生产，其中包括包被有偶联抗原的96孔酶标板，浓度分别为0、1、3、9、27、81μg/L 的磺胺嘧啶标准液，酶标二抗，抗体工作液，底物液A液和B液，终止液，20×浓缩洗涤液，2×浓缩复溶液；磺胺类药物标准品：纯度≥99%，美国Sigma公司生产；乙腈、正己烷、氢氧化钠：分析纯，北京化学试剂公司生产。

1.1.2 仪器与设备 8010S匀浆机，2000SBL电子天平，KS-Ⅱ振荡器，Anke GL-20G-Ⅱ高速离心机，DSY-Ⅲ氮吹仪，QL-901漩涡混合器，微量移液器（单道 20～200μL、100～1000μL，多道 50～300μL）：MK3 酶标仪，Acquity液相色谱串联质谱仪（配有电喷雾离子源）。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理 称取2.0g±0.05g匀浆后的样本至50mL聚苯乙烯离心管中，加入8mL乙腈-NaOH（0.1mol/L）溶液，立即用振荡器振荡5min，以4000r/min室温（20～25℃）下离心5min后，取2mL上清液至10mL干净玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；加入1mL正己烷，用漩涡混合器涡动30 s溶解干燥残留物，再加入0.5mL复溶液工作液，涡动30s后转入2mL离心管中，4 000 r/min室温（20～25℃）下离心5min；除去上层正己烷相，取下层水相50μL用于分析。

1.2.2 检测步骤 取出所需数量的微孔板，记录标准品和样品的位置；加入标准品、待测样品溶液50μL到对应的微孔中，然后加入抗体工作液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min；倒出孔内液体，用洗涤工作液（250μL/孔）充分洗涤4～5次，每次间隔10 s，用吸水纸拍干；再加入酶标二抗100μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min，重复洗板步骤；加入底物液A液和B液各50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15min；加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处测定每孔的吸光度。

1.2.3 结果计算

式中，A为标准品或样品溶液的吸光度；A0为空白液（浓度为0μg/L标准溶液）的吸光度。

以标准品百分吸光率为纵坐标，磺胺类药物标准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线。将样品的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样品所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样品中磺胺类药物的实际浓度。

2 结果与分析

2.1 标准曲线 按照1.2.2步骤，分别测定0、1、3、9、27、81μg/L磺胺甲恶唑标准液的吸光度，建立标准曲线如图1所示。其中IC50值为4.6μg/L，标准曲线R2=0.9987。

2.2 检测限 对20份空白猪肉样本进行检测，从标准曲线上查出对应于各百分吸光率的浓度，以20份样本磺胺类药物浓度的平均值（）和标准差（s）来表示检测限（MDL），即 MDL=+3s，结果获得该方法对猪肉样本的检测限为1.5μg/kg。

图1 磺胺类药物的标准曲线图

2.3 准确度和精密度 ELISA测定的准确度用回收率表示，精密度用变异系数表示。以市售空白猪肉样本为试验材料，向其中分别添加15种磺胺类药物标准品，添加浓度为100、200μg/kg，计算回收率及精密度。结果表明所添加磺胺类药物的回收率范围在76.1%～101.7%，变异系数为4.6%～11.9%，数据结果显示试剂盒重复性较好。

2.4 特异性 试剂盒特异性用交叉反应率表示：

式中，X为引起50%抑制的磺胺甲恶唑的浓度；Y为引起50%抑制的其他磺胺类药物的浓度。

表1 试剂盒特异性试验

由表1可知，该试剂盒特异性良好，可用于检测猪肉样本中磺胺甲恶唑、磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺多辛、磺胺甲噻二唑、磺胺喹恶啉、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺苯酰、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺（二甲基）异恶唑和酞酰磺噻唑15种磺胺类药物的多残留。

2.5 与LC-MS/MS作比对试验 随机抽取50份猪肉样本，分别用仪器方法与试剂盒方法检测，仪器方法参考“GB/T 21316-2007动物源性食品中磺胺类药物残留量的测定：液相色谱-串联质谱法”（该标准方法对动物组织中磺胺类药物的检测定量限为50μg/kg）。结果筛选出4份阳性样本（浓度大于50μg/kg），比对结果见表2。

表2 ELISA法和LC-MS/MS法检测结果比较 μg/kg

由表2可知，ELISA法和LC-MS/MS法测定的结果基本一致，符合度基本达到100%，适用于猪肉样本中磺胺类药物多残留的检测。

3 结论

本研究采用酶联免疫法对猪肉中的磺胺类药物残留进行了检测，灵敏度为1μg/L，对猪肉样本的最低检测限为1.5μg/kg；以100、200μg/kg磺胺类药物添加的猪肉样本，其平均回收率为76.1%～101.7%，变异系数为4.6%～11.9%；与液相色谱-串联质谱法相比，检测结果虽一致，但耗时短（75min）、样本前处理简单、仪器设备投资少、成本低，适合对大量猪肉样本中磺胺类药物多残留的快速检测，有利于我国畜禽养殖户、食品企业、政府监管部门等开展磺胺检测工作。但目前酶联免疫法筛选的检测限不统一，结果判定较困难，还可能存在假阳性问题，因此对于阳性样本，需要用LC-MS/MS、GC-MS等仪器方法作进一步确证。

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