局灶性脑缺血后神经干细胞增殖及GDNF表达变化的实验研究

于红丽，陈 彦，戚大石，刘 佩，刘朋飞，姚瑞芹

(1徐州医学院神经生物学教研室，江苏徐州221002;2徐州医学院麻醉学院)

脑缺血可激活静息的内源性神经干细胞(NSCs)，病变部位的信号可诱导其向病灶区迁移并分化为区域特异性神经细胞，与周围神经元建立突触联系，为脑缺血或其他神经退行性病变后的内源性修复提供结构及功能保证［1～3］。但脑缺血后新生的神经细胞数量很少，不足以替代损伤的神经细胞。胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)不仅可促进神经系统发育，还对脑损伤修复起重要作用。2010年5月，我们观察了局造性脑缺血大鼠NSCs增殖与GDNF表达的变化，旨在为脑缺血后NSCs的基础研究和临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 健康SD大鼠24只，体质量(250±20)g;5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)，15%和30%的蔗糖磷酸缓冲液，10%的正常羊血清;羊抗BrdU多克隆抗体(1∶1 000，Abcam)，小鼠抗巢蛋白(Nestin)单克隆抗体(1∶1 000 ，BD PharMingen)，羊抗 BrdU 多克隆抗体(1∶1 000，Abcam)，Cy3-结合的羊抗小鼠IgG荧光二抗(1∶200)和 FITC-结合的兔抗羊IgG荧光二抗(1∶200);荧光显微镜。

1.2 动物分组及大脑中动脉闭塞(MCAO)模型制备 将24只SD大鼠随机分为假手术组和模型1组、模型2组、模型3组各6只。参照本课题组前期研究［4］建立MCAO模型，即大脑中动脉栓塞后90 min拔出尼龙线，假手术组除尼龙线不阻塞大脑中动脉起始部外，其他操作与模型1组相同;实验时室温保持在23～25℃，相对湿度为60%。

1.3 动物术后处理及取材、切片制备 模型1组、模型2组、模型3组及假手术组分别于术后第3、7、14和3天腹腔注射10 mg/mL的BrdU 50 mg/(kg·次)，每4 h一次，第三次注射后4 h麻醉动物，心—升主动脉插管灌注固定，取脑组织加入4%多聚甲醛4℃过夜，其后分别加入15%和30%的蔗糖磷酸缓冲液至组织块沉底。作连续冷冻冠状切片，片厚30μm。

1.4 切片染色 取上述切片分别行BrdU、Nestin、GDNF及 BrdU/Nestin免疫组织化学染色。采用ABC法，加入3%H2O2，室温30 min;加入10%的正常羊血清，室温30 min;加入小鼠抗Nestin单克隆抗体和GDNF抗体，4℃、72 h;加生物素结合的羊抗IgG(1∶200，Vector)，37 ℃ 2 h;加 HRP 标记的卵白素—生物素复合物(1∶200，Vector)，37℃ 1 h;DAB/H2O2呈色(0.05%/0.01%)。除血清和一抗间之外其余各步骤间均以0.01 mol/L的PBS充分洗涤。阴性对照组除用0.01 mol/L的PBS代替一抗外，其余步骤同上。

1.5 BrdU标记的内源性细胞鉴定 首先将脑组织切片进行如下处理:50%甲酰胺/2×SSC，65℃ 2 h;2 N HCL，37℃ 30 min;pH值为8.5的硼酸盐缓冲液(B3BO3)，室温10 min。再按上述切片染色步骤操作，一抗为羊抗BrdU多克隆抗体，免疫荧光双标一抗为小鼠抗nestin单克隆抗体和羊抗BrdU多克隆抗体，二抗为Cy3-结合的羊抗小鼠IgG荧光二抗(1∶200)和 FITC-结合的兔抗羊 IgG荧光二抗(1∶200);10%甘油封片，荧光显微镜观察拍照，每只大鼠随机抽5取张不同断面的脑片，在200倍光镜下每张脑片选3个视野进行细胞计数。

1.6 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件进行统计学处理。计量数据以¯x±s表示，行ANOVA分析，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组织化学染色 ①Nestin染色:假手术组皮层可见染色较淡的Nestin阳性细胞，胞体和突起着色，胞体很小，有2～3个纤细的突起;模型1～3组皮层Nestin阳性细胞胞体变大，突起分支增加，呈放射状，其中模型1、2组皮层Nestin阳性细胞数目显著多于假手术组(P＜0.01)，见表1。②GDNF染色:假手术组皮层GDNF阳性细胞为神经元样，而模型1～3组GDNF阳性细胞为胶质样，其中模型2组GDNF阳性细胞数较假手术组显著增加(P＜0.05)，模型3组GDNF阳性细胞数较假手术组显著降低(P ＜0.05)，见表1。

表1 四组Nestin染色和GDNF染色阳性细胞数比较(n=6，个，¯x ±s)

2.2 BrdU标记结果 假手术组大鼠脑室下层(SVZ)有2～3层BrdU阳性细胞，核着色(见图1A);模型1～3组大鼠SVZ的BrdU阳性细胞增加，其中模型2组与假手术组相比P＜0.05(见图1B和表2)，模型3组与假手术组相似(见图1C和表2)。假手术组大脑皮层几乎检测不到BrdU阳性细胞(见图1D)，但模型1～3组大脑皮层BrdU阳性细胞均较假手术组显著增加(P＜0.01，见图1E和表2)。Nestin/BrdU免疫荧光双标结果显示，BrdU阳性细胞几乎均为Nestin阳性(见图2A～2C)。

3 讨论

图1 大鼠局灶性脑缺血后Brd U阳性细胞免疫组织化学染色情况

表2 四组BrdU阳性细胞表达比较(n=6，个，¯x±s)

图2 Nestin/BrdU免疫荧光双标染色情况

脑缺血可诱导成年在体NSCs的增殖和分化，使诱导内源性NSCs治疗缺血性脑损伤成为可能。研究表明，局灶性脑缺血后脑内NSCs的增殖表现出时空差异。脑缺血后3 d即可见海马BrdU标记的NSCs的增殖，7 d时达高峰，损伤侧BrdU阳性细胞高表达一直持续到术后4周［5］;损伤侧 SVZ的BrdU 阳性细胞 7 d 时达高峰，持续到 14 d［6，7］。另有研究报道，SVZ区细胞增殖高峰出现在损伤后第14 d，与对照组相比增加37%［8］。本研究显示，模型2、3组组SVZ部位BrdU阳性细胞均有较高表达，尤以模型2组为著;与假手术组相比，模型1、2组Nestin阳性细胞数量显著增加，且BrdU阳性细胞同时为Nestin阳性细胞。表明MCAO致脑缺血后7～14 d时NSCs细胞增殖增加，在7 d时达高峰;脑缺血后检测到的BrdU阳性细胞是NSCs。

GDNF是转化生长因子-β(TGF-β)超家族的一个相关成员，具有广谱性神经营养作用，参与脑缺血后神经组织的修复过程。在几种脑缺血模型中均可见到该蛋白基因的mRNA或蛋白本身及其受体表达。在给予外源性的GDNF实验中，发现此蛋白在脑缺血时表现出强大的神经保护作用，可使脑部梗塞面积减小、脑水肿程度减轻，存活神经元数量明显增加［9］。过表达GDNF可促进移植NSCs的存活和分化［10，11］。本研究显示，大鼠 MCAO 致脑缺血前后GDNF表达的细胞类型不同，假手术组SVZ的GDNF阳性细胞为神经元样，而模型组GDNF阳性细胞却为胶质细胞样，模型2组GDNF阳性细胞增加最为显著，与NSCs细胞的增殖时间窗基本一致。表明缺血后活化的胶质细胞可通过增加合成、分泌神经营养因子而促进NSCs的存活和增殖。

综上所述，大鼠局灶性脑缺血后3～14 d内源性NSCs增殖加快，GDNF表达增加可能对其起促进作用。

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