Notch1活化对骨髓瘤细胞株RPMI8226增殖及药物敏感性的影响

郭冬梅，李玉娟，李纯璞，白观臣，陈 晨，滕清良

(泰安市中心医院，山东泰安271000)

多发性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)是一种发生于B淋巴细胞的恶性浆细胞病，好发于中老年人，发病机制尚不明确，目前主要采用化疗、放疗、免疫及造血干细胞移植治疗。近年来，新型药物的应用使MM患者生存期有所延长，但仍有较多患者发生耐药及复发［1，2］。新近研究表明，Notch1 信号通路在多种肿瘤的发生、发展、耐药及预后中具有重要作用。2010年1月～2011年10月，我们利用携带Notch1-ICN的逆转录病毒载体感染MM细胞株RP MI8226，观察外源性Notch1信号对对MM细胞株RPMI8226增殖、周期改变及药物敏感性的影响，旨在探索Notch1通路在MM发生、发展及耐药中的作用，寻找MM治疗的新靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 人 MM 细胞株 RPMI8226，Notch1-ICN病毒(由目的基因质粒 pMSCV-ICN/GFP、包装质粒pKat和编码水泡性口膜炎病毒G-糖蛋白的包膜质粒pCMV-VSV-G包装而成)及对照病毒(CON)由山东大学齐鲁医院惠赠;CCK-8测定细胞增殖的试剂盒(上海凯基生物技术有限公司)，兔抗人Notch1单克隆抗体(Abcam公司)，碘化丙啶(Propidium iodide，PI，美国 BD 公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养、处理及鉴定 ①细胞培养、处理:取人MM细胞株RPMI8226置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，细胞生长至对数生长期后用于后续实验。首日按照每孔2×105/mL铺24孔板，同时加入0.5 mL病毒上清及Polybrene(8μg/mL)于培养箱中培养1 h，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液过夜;第2、3天，离心弃培养液，PBS洗1次，重复第1天步骤。采用限制性稀释方法获得单个细胞，筛选稳定感染细胞。获取RPMI8226-ICN及RPMI8226-CON细胞(分别为病毒组及病毒对照组)，同时设未经感染的细胞为未转染组。②鉴定:选取上述三组细胞，裂解后收集蛋白样品，采用Western blot法检测Notch1-ICN蛋白表达，按试剂盒说明书操作。

1.2.2 细胞增殖情况检测 按每孔5×103个细胞将上述三组细胞接种于96孔细胞培养板，置CO2孵箱培养4 d，其后按照CCK-8试剂盒说明操作，每孔加入10 μL的 CCK-8液，分别于24、48、72、96 h后在酶标仪波长450 nm处测定吸光度值(A值)。每个样本设3个复孔，实验重复3次。

1.2.3 药物敏感性检测 选取1.2.1中三组细胞，按1×103/孔接种于96孔细胞培养板。根据预实验结果和文献报道，分别将浓度为 0.2、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2 μmol/L 的硼替佐米加入培养体系中，培养48 h后按照CCK-8试剂盒说明操作，在酶标仪波长450 nm处测定吸光度值(A值)。根据公式(1－用药组平均A值/对照组平均A值)×100%计算细胞抑制率。每个样本设3个复孔，实验重复3次。以时间为横坐标、A值为纵坐标绘制细胞增殖曲线。

1.2.4 细胞周期检测 选取1.2.1中三组细胞制备细胞悬液，用PBS洗2次，调整细胞密度为1×106/mL;1 000 r/min离心10 min;用75%冰乙醇悬浮，4℃过夜固定;次日PBS洗涤，1 000 r/min离心10 min，去除乙醇;分别加入500 L含有RNaseA的PI溶液，4℃避光30 min;用流式细胞仪测定单个细胞核中PI-DNA含量，用掺入的PI荧光强度反映单个细胞核中DNA含量，测定细胞周期。

1.3 统计学方法 采用统计学软件SPSS13.0分析数据。计量数据以¯x±s表示，采用t检验，检验水准α =0.05。

2 结果

2.1 转染细胞鉴定 病毒组细胞Notch1-ICN蛋白表达水平约为病毒对照组及未转染组的2.5倍，见图1。

图1 三组RPMI8226细胞Notch1蛋白表达

2.2 细胞增殖情况和对硼替佐米药物的敏感性培养后48、72、96 h病毒组细胞增殖率均显著高于病毒对照组(P均＜0.01)，见图2;随硼替佐米浓度增高，各组细胞抑制作用均逐渐增加，且同浓度条件下病毒组抑制率显著低于病毒对照组及未转染组，见表1。

图2 病毒组和病毒对照组细胞增殖曲线

表1 不同浓度硼替佐米作用下三组细胞增殖抑制率(n=3，%，¯x ±s)

2.3 细胞周期 病毒组S期细胞比例明显高于其余两组(P 均 ＜0.01)，见图3。

3 讨论

图3 三组细胞周期比例

研究显示，造血系统的多种恶性疾病如白血病、淋巴瘤和MM中均存在Notch活化。Notch信号异常与多种肿瘤的发病、细胞周期阻滞和治疗预后有关。新近研究显示，Notch信号在不同肿瘤组织及肿瘤发展的不同阶段均可发挥促癌或抑癌作用。Xu等［3］研究显示，激活Notch信号可加快MM病情进展。Nefedova等的细胞周期实验结果显示，Notchl-ICN可上调S期RPMI8226细胞比例，进而促进细胞生长。贾向旭等［5］发现，病毒感染细胞可通过上调Notch1-ICN表达抑制细胞凋亡。Nefedova等［6］研究显示，阻断Notch1通路可导致细胞周期阻滞及细胞凋亡增加，并可增加细胞对化疗药物的敏感性。

为研究Notch信号通路在MM发生、发展中的作用，本研究采用逆转录病毒体系转染细胞，其特点为高效地将目的基因整合到染色体上稳定表达。结果显示，应用Notch1-ICN感染MM细胞后病毒组Notch1-ICN表达明显上调，约为病毒对照组和未转染组的2.5倍;培养后48、72、96 h病毒组细胞增殖率均显著高于病毒对照组。提示上调Notchl表达可促进RPMI8226细胞增殖。以硼替佐米为代表的新型靶向药物的出现使MM患者的缓解率和总生存率显著改善，但大部分患者仍然出现复发或耐药。为研究Notch1表达上调对药物敏感性的影响，本研究选择硼替佐米用于实验，结果显示随硼替佐米浓度增高，各组细胞抑制作用均逐渐增加，且同浓度条件下病毒组抑制率显著低于病毒对照组及未转染组。说明Notch1通路活化可使RPMI8226细胞对硼替佐米敏感性降低。此外，本研究还显示病毒组S期细胞比例明显高于其余两组。提示外源性Notchl活化可通过增加S期细胞比例促进MM细胞增殖，还可降低MM细胞对硼替佐米的敏感性。

综上所述，Notch1信号通路活化与MM的发生、发展及耐药密切相关，有望成为MM治疗的新靶点。

［1］Piro E，Kropp M，Cantaffa R，et al.Visceral leishmaniasis infection in a refractory multiple myeloma patient treated with bortezomib［J］.Ann Hematol，2012 May 15.［Epub ahead of print］

［2］Kumar SK，Lee JH，Lahuerta JJ，et al.Risk of progression and survival in multiple myeloma relapsing after therapy with IMiDs and bortezomib:A multicenter international myeloma working group study［J］.Leukemia，2012，26(5):1153.

［3］Xu D，Hu J，Xu S，et al.Dll1/Notch activation accelerates multiple myeloma disease development by promotingMM-cell proliferation［J］.Leukemia，2011，Nov 18.doi:10.1038/leu.2011.332.［Epub ahead of print］

［4］Nefedova Y，Sullivan DM，Bolick SC，et al.Inhibition of Notch signaling induces apoptosis of myeloma cells and enhances sensitivity to chemotherapy［J］.Blood，2008，111(4):2220-2229.

［5］贾向旭，鲁茁壮，王华，等.激活Notch信号抑制多发性骨髓瘤细胞凋亡［J］.中国实验血液学杂志，2004，12(3):335-339.