轻度认知障碍患者血小板中α、β－分泌酶基因表达水平及其临床意义

何池忠 刘新通 王丽娟 张 雄 徐书雯 莫建伟 李东风

轻度认知障碍（mild cognitive impairment，MCI）是指介于正常老化和痴呆之间的一种过渡阶段的认知障碍，是老年性痴呆（Alzheimer disease，AD）发生的高危人群。在美国 MCI的发病率为9.9‰老年人，进展为 AD的年发生率为6%～25%［1］，有学者认为作为正常老化向AD发展的过渡状态，MCI是AD药物干预的最佳时机。但目前临床上尚缺乏一种敏感的客观的检测指标指导医生对MCI进行准确的分型诊断及预后判定，一定程度上影响了AD早期干预的实施。α分泌酶（ADAM10）、β分泌酶（BACE1）是β淀粉样前体蛋白（APP）的裂解酶，是影响Aβ产生的主要因素，可能在AD发病的早期机制中发挥重要作用［2］。本研究应用实时荧光定量PCR（FQ－PCR）及ELISA技术检测了MCI患者外周血中的ADAM10、BACE1基因表达水平及Aβ42浓度，探讨ADAM10、BACE1在MCI分型诊断及预后判定中的作用和意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象 来自广东省人民医院神经内科及老年医学研究所神经内科病房和门诊2007年1月～2008年1月期间就诊的MCI患者。符合Peterson等MCI诊断标准［3］，诊断采用MCI国际工作组修订的MCI诊断程序。纳入标准包括主诉有记忆减退，病程≧3个月；有记忆减退的客观证据；简易精神评定量表（MMSE）≥24分；临床痴呆量表（CDR）0.5分；一般认知功能与日常生活能力保持正常；无痴呆。排除标准包括明确的痴呆、明确的脑卒中病史及其他可引起脑功能障碍的躯体和精神疾病。共28例，男13例，女15例，年龄52～81岁，平均年龄（67.74±7.40）岁，受教育年限3～15年，平均（9.12±3.75）年。

对照组设AD组和正常老年组。AD病例来源同MCI组。AD的诊断采用CCMD—Ⅲ—R有关AD的诊断标准，共28例，男16例，女12例，年龄57～84岁，平均年龄（69.17±8.14）岁，受教育年限4～13年，平均（8.05±3.44）年。正常老年组来源于本院体检中心的正常老人，共21例，男10例，女11例，年龄59～79岁，平均年龄（68.09±5.22）岁，受教育年限7～17年，平均年龄（10.65±2.84）年。MCI组和AD组、正常老年组的年龄、受教育年限比较无明显差异（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 血小板标本的采集 均抽晨静脉血10 ml，2%EDTA抗凝，离心1 500 r／min×15 min，将上层的富血小板血浆转移至塑料管中，离心3 500 r／min×5 min，分离上清并分别置于－20℃冰箱保存。

1.2.2 FQ－PCR 检 测 ADAM10、BACE1 mRNA表达水平

1.2.2.1 引物设计与合成 利用 Primer premier 5.0软件设计，由Invitrogen公司合成。ADAM10：5＇－ACAGTGCAGTCCAAGTCAAG－3＇（forward），5＇ACACGTACACTCCTCTAAGC 3＇（reverse），片段长244 bp。BACE1 5＇CATCCTTCCGCAGCAATACC3＇（forward），5＇TGCCGTCCTGAACTCATC GT3＇（reverse），片段长208 bp，内参照 GAPDH 5＇AGCCTCAAGATCATCAGC3＇（forward），5＇GAGT CCTTCCACGATACC3＇（reverse），片段长度96 bp。

1.2.2.2 总 RNA提取和cDNA合成 采用 Trizol试剂盒（Invitrogen），按说明书提取血小板中的总RNA，1.2%琼脂糖电泳鉴定血小板中总RNA；使用Prime Script TM逆转录试剂盒（Takara）合成cDNA，反应体系共25μl，包括10×PCR buffer 2.5 μl，d NTP 1μl，dd H2O 18.15μl，Taq酶0.35μl，上游外引物（10 pmol／L）1μl，下游外引物（10 pmol／L）1μl，RNA模板：1μl。反应条件为95℃3 min，94℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，共30个循环，72℃10 min终止反应，4℃保存。

1.2.2.3 制备标准曲线和样本的FQ－PCR检测将扩增的PCR产物进行核酸电泳，使用胶回收试剂盒（天根生化科技，北京）对目的条带进行切胶回收纯化；对回收纯化的DNA测OD260及OD280，计算其浓度及纯度，稀释成106copies／ul作为标准曲线的第一个梯度；再将各标准样品以10倍梯度倍比稀释，共做5个梯度；实时检测仪（ABI 7300）上扩增并检测荧光；计算机自动根据阈循环（Cycle threshold，Ct）值与对应模板的拷贝数对数作图，绘制标准曲线；样本的检测按照SYBR Green荧光定量PCR试剂盒（Takara）说明书进行；反应体系共20μl，包括SYBR Green Real time PCR Master Mix 9μl，dd H2O 6μl，上游内引物 F（10 pmol／μl）2μl，下游内引物 R（10 pmol／μl）2μl，cDNA 产物1μl。反应条件为95℃2 min，94℃15 s，60℃30 s，72℃35 s，共30个循环，在反应的第二步94℃末读取荧光值，反应结束后进行融解曲线分析。

1.2.3 ELISA 检测血浆中 Aβ42水平 ELISA 试剂盒由EHSY Lab（香港）赠送，按说明书操作：常温下解冻血浆，加蛋白酶抑制剂AEBSF（Sigma）至1 mmol／L，以防止Aβ降解。取出已包被的酶联板（96孔），设空白孔、标准孔、待测样品孔，分别加标准品或样品100μl，覆膜封存置室温下2 h，弃液甩干，加Aβ42抗体反应液100μl，覆膜封存置37℃下孵育2 h，弃液甩干，加二抗反应液100μl，覆膜封存置室温下2 h，弃液甩干，加底物及终止液，490 nm下读取吸光度值。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 目的基因的定量曲线与熔解曲线分析

在FQ－PCR反应体系中每经过一个循环，收集一次荧光信号，从而得到一条荧光扩增曲线，同时给出荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数，即Ct值；Ct值与模板的起始拷贝数的对数呈线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小；通过计算ΔCt值确定目的基因的相对表达水平。ADAM10、BACE1的定量曲线见图1、2。熔解曲线分析发现ADAM10、BACE1的PCR产物均呈较为锐利的单一峰（图3、4），Tm分别为83.9℃和85.1℃，没有其他杂峰出现。

图1 ADAM10基因定量曲线

图2 BACE1基因定量曲线

图3 ADAM10基因熔解曲线

图4 BACE1基因熔解曲线

2.2 血小板中ADAM10、BACE1基因的表达水平

每个样品重复扩增3次取均值，ΔCt值由计算机软件自动计算得出（表1）。AD、MCI组BACE1m RNA表达水平是正常老年组的4.51倍、2.22倍，有显著性差异（F＝4.847，P＜0.05）。

表1 血小板中ADAM10、BACE1基因的表达水平（±s，ΔCt）

表1 血小板中ADAM10、BACE1基因的表达水平（±s，ΔCt）

注：与正常老年组比较，△P＜0.05；与 MCI组比较，▲P＜0.05

mRNA正常老年组 21 1.13±0.16 0.64±0.组别 n ADAM10 m RNA BACE1 22 AD组 28 211.61±0.11 2.89±0.20△▲MCI组 28 0.97±0.17 1.42±0.17△

2.3 血浆中Aβ42水平及相关性分析

MCI组、AD组及正常老年组的Aβ42水平中位数分别为250（90～680）ng／L、210（110～500）ng／L及160（75～630）ng／L，3组比较无明显差异（F＝2.772，P＞0.05）。将 Aβ42值分别与 ADAM10ΔCt值、BACE1ΔCt值进行Spearman相关性分析显示，Aβ42含量与ADAM10基因表达水平（r＝－0.1442，P＞0.05）及BACE1基因表达水平（r＝0.161 1，P＞0.05）均无关。

3 讨 论

MCI不是一个疾病单元，而是一个异质性临床综合征，其临床转归并不相同。最近在欧洲完成的一项多中心研究发现750例MCI患者经过至少2年的追踪后，其中36%转化为AD，8%转化为血管性痴呆或其它类型的痴呆，52%病情保持稳定不转化为痴呆，4%逆转成正常［4］。Peterson也认为遗忘型MCI易转化成AD，血管型MCI易转化成血管性痴呆或其它类型的痴呆［3］。因此，临床上迫切需要一种或几种生物指标能够作为MCI临床分型、转归判定的客观依据，以指导开展痴呆的早期干预。近些年来的研究提示MCI脑脊液中乙酰胆碱转移酶水平、总tau含量、磷酸化tau含量、总tau／Aβ42／40比值、磷酸化tau／Aβ42／40比值、Aβ42／Aβ40比值、apoE基因型等均可能成为临床候选指标［5，6］。也有研究者发现 MCI患者血浆中的 Aβ42、Aβ40水平、Aβ42／Aβ40比值、血小板中的BACE1活性及APP异构体比率等可能具有预后判定的价值，但由于重复性差或检测复杂、费用昂贵等原因这些指标一直未能在临床推广［7，11，12］。本研究采用 FQ－PCR 技术检测了MCI患者血小板中的ADAM10、BACE1的基因表达水平，发现AD、MCI患者BACE1mRNA表达水平是正常老人的4.51倍、2.22倍，且在AD中表达也高于MCI，这提示MCI血小板中BACE1mRNA的高表达可能具有临床预测意义。这与目前的相关研究结论相一致［8，9］。Henrik等还发现 MCI患者血浆中BACE1活性与β淀粉样前体蛋白（APP）的代谢产物s APPα、s APPβ、Aβ42、Aβ40水平有关［10］。本研究用ELISA法检测3组血浆中的Aβ42水平，没有类似发现，可能与本研究样品量少、诊断标准、检测对象及方法不同有关。

在MCI向AD转化的病程中一个主要的病理改变是患者的海马、大脑皮质及其他脑区出现大量Aβ淀粉样沉积，而Aβ的形成与其前体蛋白APP的异常酶切加工有关。正常情况下APP经α分泌酶（ADAM10）裂解产生可溶性s APPα及C83，可溶性APP对神经细胞具有营养和保护作用，病理状态下APP裂解由β，γ分泌酶介导，可产生大量致病性的Aβ42、Aβ40。BACE1是产生 Aβ的限速酶，其活性水平决定APP的代谢途径。已经证实BACE1是一类天冬酰氨蛋白酶，其基因定位于人类的11q23.2染色体，全长2 526个碱基对，包含9个外显子。BACE1表达同时受转录和翻译水平的调控，但转录和翻译调控的机制目前并不十分清楚。研究表明BACE1是一种应激蛋白，缺血［13］、缺氧［14］、脑损伤及能量剥夺［15］均可诱导BACE1mRNA表达上调及活性增加。O’Corner等的研究证实能量剥夺能够激活转录启动因子eIF2α磷酸化通道加快BACE1的转录效率，进而引起BACE1及Aβ的上调［16］。本研究中 AD、MCI患者的BACE1m RNA上调是否与慢性缺血、缺氧及能量障碍诱导的转录启动因子eIF2α磷酸化有关，值得进一步研究。Sandra等报道MCI患者脑脊液中BACE1活性与P－tau、T－tau水平高度相关，推测BACE1表达上调的原因可能与磷酸化tau蛋白的调节有关［17］。另外，作为产生Aβ的限速酶，BACE1上调不仅提供了MCI分型诊断的临床线索，同时还为MCI早期药物干预提供了靶点。α－分泌酶与AD的关系目前还不明晰，其活性需通过神经递质受体系统激活，故在实际应用中受到限制。

既往分析α、β－分泌酶基因表达水平所采用的方法如RT－PCR、Northern杂交以及RNA酶保护试验等，操作繁杂，敏感性低且易于污染。本研究采用的实时荧光定量PCR法则克服了上述缺点［18］，在PCR反应过程中巧妙地将靶基因扩增、杂交及光谱检测技术结合在一起，PCR扩增和终产物检测全处于封闭的条件下进行，可以对靶基因的表达水平进行准确定量，易于临床推广。

总之，本研究成功建立了检测α、β－分泌酶基因表达的实时荧光定量PCR法，并发现AD、MCI患者血小板β－分泌酶基因表达水平高于正常老人，其意义在于一方面显示了血小板β－分泌酶基因表达上调可能与MCI的转归（向AD转化）有关，要求对于MCI患者应尽早开展相关的酶学检查，以实施早期药物干预；另一方面提示β－分泌酶本身是一个值得干预的靶点。当然尚需要更大样本量以及动态的追踪研究进一步证实。

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